骨格筋のカルタトキシン媒介損傷と自己送出型siRNAの注射を組み合わせて、衛星細胞における特定の遺伝子の機能的損失を調べるためのインビボ法について述べた。
骨格筋は、怪我の後に再生する巨大な能力を持っています。このプロセスは、主に筋肉幹細胞によって駆動され、衛星細胞とも呼ばれます。衛星細胞は、転写因子Pax7の発現および安静時骨格筋における基底ラミナの下の位置によって特徴付げられる。損傷時に、衛星細胞が活性化し、自己更新または分化を受け、新しい筋線維を形成するか、損傷したものと融合する。生体内の衛星細胞の機能性は、骨格筋のカーディオトキシンベースの傷害モデルを用いて調べることができる。骨格筋の再生中に1つの遺伝子の機能を研究するために、トランスジェニックマウスモデルが主に使用されます。ここで、トランスジェニックマウスに代わる方法を提示し、再生時の衛星細胞における遺伝子機能を調べ、例えば、トランスジェニックマウスが利用できない場合に。特定の骨格筋のカートトキシン媒介損傷と自己送出型siRNAを再生筋に注入し、他の細胞の間で衛星細胞によって取り込まれる。そこで、トランスジェニックマウスを必要とせずに生理的条件下での再生時に衛星細胞の遺伝子機能を解析する方法を提供する。
骨格筋は、体全体の約40%を占む体の最大の組織であり、自発的な移動を可能にします。骨格筋の組織構造は、主に、末端分化、多核化筋線維、ならびに末梢神経系、血管系、および間質細胞1からなる様々な他の細胞から構成される。重要なことに、骨格筋は、怪我や損傷2の際に機能を再生し、復元する膨大な能力を持っています。このプロセスは、サテライトセル3、4とも呼ばれる組織常駐筋幹細胞に依存する。衛星細胞は、筋線維と基底ラミナの間に位置し、転写因子Pax75、6、7の発現によって特徴付けされる。恒静性条件下では、衛星細胞は静止しているが、外傷性損傷のために活性化される、例えば、偏心運動を通じて、またはヘビ毒カーディオトキシン6、8の注射を通じて実験的に。一旦活性化されると、Pax7陽性衛星細胞はMyoDとMyf5を共発現し、幹細胞を筋原分化にコミットする。コミットメント因子のアップレギュレーションに抵抗する衛星細胞は、その幹細胞の可能性を保持し、将来の需要のために幹細胞プールを補充するために静止に戻ります。ミオゲン前駆体プールの拡大後、転写ネットワークはミオゲニンのような分化因子によって活性化され、細胞周期の出口および末端分化を開始する。これらの筋生殖器は、お互いに融合するか、またはミオ核ドメインの大きさを維持するためにミオヌクレイに寄与する既存の筋線維に融合する。筋線維は、ミオシンヘビーチェーンのような末端筋分化遺伝子を発現する。最後に、新たに形成された筋線維は成長し、骨格筋9、10の機能単位を構築するために成熟する。
骨格筋の再生は、軽度の障害から生命を脅かす状態に至るまで、筋肉疾患や老化11、12を含む様々な状態の影響を受ける可能性があります13,したがって、再生医療は、衛星細胞機能15,16を標的とすることにより、本来の再生力を用いて損傷または機能不全の骨格筋組織を回復することを目指す。その可能性を最大限に活用するには、骨格筋の再生中に内因性のニッチで衛星細胞を包括的に理解することが必要です。ミオファイバー17に隣接する衛星細胞を単離する実験的アプローチは存在するが、衛星細胞と環境との細胞と全身的相互作用の完全な複雑さは、生体内でのみ要約することができる。その点で、骨格筋再生に関する大きな知識は、マウス傷害モデル2,18を用いて獲得されている。
ここでは、生体内の脛骨前筋のカーディオトキシン誘発損傷の幹細胞媒介再生を研究する特定の実験的マウス傷害モデルを紹介する。心筋線脱分極と壊死を引き起こすヘビ由来の細胞溶解性毒素であるカーディオトキシンは、脛骨前筋に注入され、その後、組織変性を引き起こし、再生が続く。急性再生時の遺伝子の機能を解析するために、自己送達型siRNAは、人工衛星細胞膨張のピーク時に、損傷後3日目に注入される。実験動物は様々な時点で犠牲になり、脛骨前筋が採取される。解剖された筋肉は凍結され、さらに凍結断面のために処理される。免疫蛍光顕微鏡は、再生のマーカーを分析するために使用されます。この方法は、野生型マウスを用いて人工筋の人工筋肉の人工的な再生中に単一遺伝子の機能を調べた。
ここでは、トランスジェニック動物を必要とせずに骨格筋の再生中に特定の遺伝子の機能を調べるための方法を紹介する。これは、カーディオトキシン誘発筋損傷の組み合わせと、損傷後3日目に再生骨格筋に自己送達siRNAを注入することによって達成される。カーディオトキシンによる筋肉損傷の手順、自己送出型siRNAの注射、収穫した筋肉の処理を詳細に説明し、再生の進行を分析した。我々は、骨格筋へのヘビ毒カーディオトキシンの注入が効果的に全筋肉を傷つけ、自己送出siRNAが他の細胞タイプの中で全ての衛星細胞の約75%に見つかることを実証する。骨格筋の再生(図4、図5)。
特に注意は、様々な程度の損傷が再生結果に影響を与え、それによってsiRNAの効果が影響を受ける可能性があるため、脛骨前筋の均質な損傷に焦点を当てる必要があります。さらに、再生領域全体に自己送出型siRNAを注入することが極極む極大な重要である。再生プロセスの分析のために、常に再生骨格筋の同様の領域を比較することをお勧めします, したがって、脛骨前筋は、常に筋肉の中腹領域を比較するために半分にカットする必要があります.筋肉を分析する際には、筋線維組成が脛骨前筋で異なるため、異なる再生が生じる可能性があるため、凍結切除全体を分析する必要があります。
衛星細胞の機能は、隣接する単一筋線維17上の培養を含む様々な実験手順により、移植や誘発後の骨格筋の再生解析によって調べることができる。18、19.生体内誘導傷害モデルを用いて衛星細胞の機能を調べると、例えば、カージアトキシンの注入は、マクロファージなどの他の細胞型との相互作用の観点からも衛星細胞機能を解析する能力を提供し、全身要因の影響の調査2.骨格筋の損傷は、様々な手段によって達成することができ、例えば、偏心運動、凍結損傷、BaCl2の注射またはカーディオトキシンまたはノテキシン18などのヘビ毒の注射。偏心運動はおそらく最も生理的傷害法であるが、1つの特定の筋肉への傷害は限られた20である。凍結傷害は、損傷部位に向かう衛星細胞の移動が研究の目的である場合、または筋肉の特定の部分だけが負傷する必要がある場合に適用することができる。実験的に凍結傷害の欠点は、予調整された金属プローブを適用するために行う必要がある開いた手術です。BaCl2またはヘビ毒の注入は、傷害の最も劇的な方法であり、それによって最も困難な衛星細胞機能に挑戦する。さらに、注射は最小限に侵襲的であり、手術時間は、一般に、5分未満であり、縫合等を伴わないことにより、感染のリスクを最小限に抑える。
筋肉損傷は、主に遺伝子機能の喪失の機能的結果を調査するために使用され、例えば、Pax77、21の喪失。特に老化したマウスが科学的な問題の焦点である場合、トランスジェニックマウスの生成または使用はしばしば実現不可能である。特定の遺伝子を標的とする自己送達siRNAの注射は、これらの場合に実行可能な代替手段であり、正常に使用されている22.簡単に言えば、マウスの脛骨前筋は、カルタトキシンの注射によって損傷を受け、フィブロネクチン(FN)に対して向けられた自己送出型siRNAは、損傷後3日目に注射された。筋肉は傷害の10日後に分析され、siFN対スクランブルsiRNA制御条件で衛星細胞数の有意な減少が観察された。ノックダウン効率は、siRNA注射の2日後に定量的リアルタイムPCRにより全筋肉分解能で判定し、58%の発現レベルの低下が達成され、送達およびノックダウン効率が機能のために十分であることを示唆した分析22.ノックダウン効率をテストするための代替手段は、標的遺伝子に対する抗体を用いて免疫ブロットまたは免疫蛍光分析のいずれかである。生体内注射に使用されるsiRNAの効率および特異性は、例えば、単離された衛星細胞または原発性筋芽細胞における効率を試験することによって、マウスへの注射前に決定されるべきである。4つの異なるsiRNAと単一のsiRNAで構成されるスマートプールを使用すると、ノックダウンの効率が向上するだけでなく、非特異的ターゲティングのリスクも高まります。使用されるすべてのsiRNA配列の特異性は、オフターゲット効果を避けるために細胞培養で試験されるべきである。コントロールとして、非標的型スクランブルsiRNAは、siRNA当たりの注入が注射による再生プロセスに影響を与え、それによって筋肉の追加損傷に影響を与える可能性があるため、使用されるべきである。siRNAを注入する時間は、科学的な質問と標的遺伝子の発現プロファイルに依存する。一般に、カーディオトキシン損傷後の3日目に自己送達するsiRNAを注射することは、衛星細胞増殖が傷害後3日目にピークを迎えるので、衛星細胞増殖に重要なほとんどの遺伝子を標的とする。最初のsiRNA注射の時点は、カーディオトキシンの注射量が非常に高く、液体の再吸収が筋肉に追加の溶液を注入する前に行われるべきであるので、カーディオトキシン損傷後48時間未満であるべきである。一般に、siRNAの複数の注射または異なるsiRNAの組み合わせが可能であるが、再生筋肉への各注射が追加の損傷を引き起こしていることを考慮しなければならない。
記載された方法の1つの制限は、観察される効果が必ずしも衛星細胞における標的遺伝子のノックダウンに依存するのではなく、免疫細胞または線維脂肪殖前駆細胞などの他の細胞型に起因する可能性があるという事実である。したがって、これらの実験を衛星細胞の純粋な集団を調べた実験と組み合わせる必要がある。1つは、衛星細胞が隣接する筋線維上で培養される浮遊筋線培養を用いて実験を行うか、単離衛星細胞17を用いて移植実験を行うことができる。
自己送出型siRNAの注射に代わりは、科学的な質問に応じて実行できる低分子阻害剤または組換えタンパク質の注入である。例えば、JAK/STATシグナル伝達の細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチンまたは低分子阻害剤の注入は、老化マウス15,16において正常に行われている。骨格筋の再生中に1つの特定の細胞型における特定の遺伝子機能の解析は、例えば、衛星細胞において、誘導可能な遺伝的マウスモデルの使用によってのみ可能である。自己送出siRNA、組換えタンパク質または小分子阻害剤の注射は、骨格筋の再生において複数の細胞タイプに影響を与える可能性がある。
The authors have nothing to disclose.
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |