Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.
Abstract
Para entender a função de um órgão, muitas vezes é útil entender o papel de suas populações de células constituintes. Infelizmente, a raridade de populações de células individuais muitas vezes torna difícil obter material suficiente para estudos moleculares. Por exemplo, a glândula acessória do sistema reprodutivo masculino de Drosophila contém dois tipos distintos de células secretoras. As células principais compõem 96% das células secretoras da glândula, enquanto as células secundárias (SC) compõem o restante 4% das células (cerca de 80 células por macho). Embora ambos os tipos da pilha produzam componentes importantes do líquido seminal, somente alguns genes são sabidos para ser específicos aos SCs. A raridade do SCs tem, até agora, dificultado o estudo da análise transcriptômica deste importante tipo de célula. Aqui, um método é apresentado que permite a purificação de SCs para extração de RNA e seqüenciamento. O protocolo consiste em primeiras glândulas dissecantes de moscas expressando um repórter GFP específico do SC e, em seguida, sujeitando essas glândulas à digestão da protease e dissociação mecânica para obter células individuais. Seguindo estas etapas, as pilhas individuais, vivas, GFP-marcadas são classificadas usando um classificador de célula ativado fluorescente (FACS) para a purificação do RNA. Este procedimento rende RNAs SC-específicos de ~ 40 machos por a condição para a jusante RT-qPCR e/ou o sequenciamento do RNA no curso de um dia. A rapidez e simplicidade do procedimento permite o transcriptoma de muitas moscas diferentes, de diferentes genótipos ou condições ambientais, a ser determinado em um curto período de tempo.
Introduction
Os órgãos são compo de tipos múltiplos da pilha, cada um com funções discretas e expressando às vezes vastamente jogos diferentes dos genes. Para obter uma compreensão precisa de como um órgão funciona, muitas vezes é crítico para estudar cada tipo de célula distinta que compõe este órgão. Um dos principais métodos utilizados para explorar a possível função é a análise do transcriptoma. Este método poderoso fornece um instantâneo da expressão de gene em uma pilha, para revelar processos e caminhos ativos. Entretanto, este tipo de análise é frequentemente difícil para as populações raras da pilha que devem ser purificadas das pilhas vizinhas distante mais-abundantes. Por exemplo, a glândula acessória masculina de Drosophila é um órgão compo primeiramente de dois tipos secretora da pilha. Como o mais raro dos dois tipos da pilha compreende somente 4% das pilhas desta glândula, o uso de uma análise específica do transcriptoma do Cell-Type não tinha sido usado para ajudar a determinar a função destas pilhas.
As glândulas acessórias (AGs) são órgãos do trato reprodutivo masculino em insetos. Eles são responsáveis pela produção da maioria das proteínas do fluido seminal (proteínas do fluido seminal (SFPs) e proteínas de glândula acessória (ACPs)). Alguns desses SFPs são conhecidos por induzir as respostas fisiológicas e comportamentais em fêmeas acasaladas, comumente chamadas de resposta pós-acoplamento (PMR). Alguns dos PMRs incluem: uma taxa aumentada da ovulação e do ovo-colocação, o armazenamento e a liberação do esperma, uma mudança na dieta fêmea, e uma diminuição na receptividade fêmea aos machos cortejando secundários1,2. Como os insetos impactam muitas questões societais importantes da saúde humana (como vetores de doenças mortais) para a agricultura (insetos podem ser pragas, ainda são críticas para a polinização e qualidade do solo), a compreensão da reprodução de insetos é uma importante área de pesquisa. O estudo de AGs e de ACPs foi avançado significativamente com o modelo do organismo Drosophila melanogaster. Estes estudos têm destacado o papel da AGS e algumas das proteínas individuais que produzem na criação do PMR, impactando o trabalho em outras espécies como ovetor dedoença Aedes aegypti3,4, eoutros insetos1 ,5. Além disso, como AGS secretam os constituintes do fluido seminal1,6eles são muitas vezes pensado como o análogo funcional da glândula prostática de mamíferos e vesicle seminal. Esta semelhança da função combinada com as similaridades moleculars entre os dois tecido-tipos, fêz ao AGs um modelo para a glândula de próstata nas moscas7.
Dentro do macho de Drosophila , há dois lóbulos de glândulas acessórias. Cada lobo pode ser visto como uma estrutura de saco-like compo de um monocamada de pilhas secretora que cercam um lúmen central, e envolvido por músculos lisos. Como mencionado acima, há dois tipos de células secretoras morfologicamente, desenvolvimentais e funcionalmente distintas que compõem esta glândula: as células principais em forma de poligonal (tornando-se ~ 96% das células), e as células secundárias maiores, redondas (SC) (tornando-se o restantes 4% das células, ou cerca de 40 células por lobo). Tem sido demonstrado que ambos os tipos de células produzem conjuntos distintos de ACPs para induzir e manter o PMR. A maioria dos dados obtidos até o momento destacam o papel de uma única proteína no desencadeamento da maioria dos comportamentos característicos da PMR. Esta proteína, o peptídeo sexual, é um pequeno, 36 aminoácido peptídeo que é secretado pelas células principais8,9,10. Embora o peptídeo sexual pareça desempenhar um papel importante na PMR, outros ACPs, produzidos por ambas as células principal e secundária, também têm demonstrado afetar vários aspectos da PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Por exemplo, com base em nosso conhecimento atual, as SCs, por meio das proteínas que produzem, parecem ser necessárias para a perpetuação da sinalização de SP após o primeiro dia18.
Dada a raridade das SCs (apenas 80 células por macho), todo o nosso conhecimento sobre estas células e as proteínas que produzem provém de abordagens genéticas e candidatas. Até agora, somente uma lista relativamente pequena de genes foi mostrada para ser SC-specific. Esta lista inclui o proventrículo defeituoso da proteína de homeodomínio (DVE)19, o lncrna MSA20, Rab6, 7, 11 e 1921, CG1656 e CG1757511, 15,21 e o fator de transcrição homeobox abdominal-b (Abd-b)18. Previamente, nós mostramos que um mutante deficiente para a expressão de Abd-B e o Lncrna MSA em pilhas secundárias (mutante deIAB-6cocuD1 ) encurta o comprimento do PMR de ~ 10 dias a somente um dia12 , 18 anos de , 20. este phenotype parece ser causado pelo armazenamento impróprio de SP no intervalo reprodutivo fêmea12,18,20. No nível celular, as células secundárias deste mutante mostram morfologia anormal, perdendo suas estruturas características vacuol-like18,20,21. Usando esta linha mutante, nós tentamos previamente identificar os genes envolvidos na função do SC comparando os perfis transcricional de AGS inteiros do tipo selvagem ou das glândulas acessórias do mutante12. Além disso, outros laboratórios mostraram que o número de SC, a morfologia e o conteúdo vacuolar dependem da dieta masculina, do estado de acasalamento e da idade21,25,26.
Embora o progresso positivo fosse feito usando estas aproximações, um transcriptoma completo do SC era longe de ser conseguido. A raridade destas pilhas neste órgão fêz difícil progredir mais mais mesmo das pilhas selvagens do tipo. Para testar a expressão gênica, as alterações nessas células após estímulos ambientais específicos seriam ainda mais difíceis. Assim, foi necessário um método para isolar e purificar o RNA SC que foi rápido e simples o suficiente para atuar diferentes origens genéticas e condições ambientais.
Ambos os genes de Abd-B e de MSA exigem um potenciador específico de 1,1 KB do complexo do bithorax de Drosophila (chamado o potenciador D1 ) para sua expressão em SCs18,20. Esse potenciador tem sido usado anteriormente para criar um driver GAL4 que, quando associado a um UAS-GFP, é capaz de direcionar a expressão GFP forte especificamente no SCs. Assim, utilizamos esta linha como base para um protocolo FACS para isolar essas células tanto do tipo selvagem como do IAB-6cocuD1 AGS). Como IAB-6cocuD1 Mutant SCs exibem uma morfologia celular diferente, nós mostramos que este protocolo pode ser usado para isolar as células para a determinação de seu transcriptoma a partir deste tipo de células raras condições vastamente diferentes.
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Protocol
linhas 1. Drosophila usadas e coleção dos machos
- Para este protocolo, use machos expressando GFP no SCs e não nas células principais. Aqui, um excitador de abdb-GAL4 (descrito na referência18), recombined com UAS-GFP (no cromossoma 2) é usado. Outros drivers apropriados também podem ser usados. Para a isolação de SCs circunstâncias diferentes do mutante, cruze a mutação nas linhas que contêm a linha SC-específica de GFP.
- Colete dois lotes de cerca de 25 homens saudáveis e virgens para cada genótipo e envelhecê-los a 25 ° c por 3-4 dias em frascos com comida de Drosophila recém-feita.
Nota: Como a idade, o status de acoplamento, a nutrição e o ambiente social afetam cada biologia reprodutiva, os protocolos estritos devem ser seguidos para controlar para estes parâmetros. Os machos virgens são envelhecidos por 3-4 dias após a eclosão do pupal em 25 ° c com um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, no alimento padrão da farinha de milho-Agar-fermento, nos grupos de 20-25 machos por o frasco.
2. soluções e preparação de material
-
Prepare as seguintes soluções.
- Prepare o meio suplementado do soro (SSM): o meio da Drosophila de Schneider complementou com o soro fetal bovino inativado do calor de 10% e a penicilina-estreptomicina de 1%.
- Prepare alíquotas de enzima de tripsina 1x (por exemplo, enzima TrypLE Express) e armazene à temperatura ambiente.
- Prepare alíquotas de papaína [50 U/mL] (armazenadas a-20 ° c e descongelados apenas uma vez).
- Prepare 1 tampão fosfato salina (PBS, armazenado à temperatura ambiente).
-
Prepare várias pontas de Pipet arredondadas à chama para a dissociação física das glândulas acessórias.
Nota: use pontas baixas da retenção para segurar as glândulas acessórias como tendem a aderir ao plástico não tratado. O processo de arredondamento de chamas reduz a abertura da ponta e suaviza as bordas da ponta. Isto assegura uma dissociação eficiente após a digestão do peptidase sem cortar as membranas de pilha.- Cortar 1 200 μL de ponta com uma lâmina afiada e passá-lo suavemente sobre uma chama para arredondar a sua ponta de modo a que a abertura seja mais larga mas suave para o manuseamento durante o passo 3,7.
- Estreite a abertura de várias pontas de 1.000 μL, passando a abertura da ponta perto de uma chama por menos de um segundo. Gire a ponta ligeiramente para evitar excesso de derretimento ou entupimento. Classifique as dicas feitas de mais estreito para mais largo. Isto pode ser feito cronometrando a velocidade da aspiração. Tente dissociar uma amostra pequena escala de AGs para testar a eficiência das pontas mais estreitas.
Nota: Estas pontas são críticas para a agitação mecânica (etapas 5,2 e 5,3). As pontas Flame-arredondadas da qualidade do Pipet permitem a dissociação completa ao preservar a viabilidade da pilha. Como tal, estas pontas são lavadas completamente com água no fim do procedimento para a reutilização. Isto permite a dissociação reprodutível do dia a dia.
3. dissecção de glândulas acessórias
- Põr 20 a 25 Drosophila masculino em um prato de vidro no gelo.
- Dissecar 1 macho em SSM. Retire o seu trato reprodutivo e limpe o par de glândulas acessórias de todos os outros tecidos para além do Ducto ejaculatório.
Nota: Remover testículos porque o esperma liberado pode criar aglomerantes e perturbar o processo de dissociação. Retire o bulbo ejaculatório, o que torna a manipulação difícil quando flutua. - Com fórceps, transfira as glândulas acessórias a uma placa de vidro enchida com o SSM na temperatura ambiente. Repita os passos 3.2-3.3 20 vezes para obter um lote de 20 pares de glândulas no SSM.
Nota: Estes passos serão alcançados em 15 a 20 min. AGs deve parecer saudável, e os movimentos peristálticos da camada muscular em torno das glândulas devem ser visíveis. GFP pode ser monitorado usando um microscópio fluorescente. - Transfira as glândulas acessórias para 1X PBS para uma lavagem de 1-2 min à temperatura ambiente.
Nota: Para uma melhor dissociação, é imperativo enxaguar as glândulas com PBS. A duração desta etapa, no entanto, deve ser limitada à medida que as células mostram sinais de stress em PBS; células secundárias dissociadas em PBS rapidamente incham e morrem. - Diluir 20 μL de papaína [50 U/mL] em 180 μL de enzima de tripsina 1x para obter a solução de dissociação (para aumentar ou diminuir a escala, manter 9 μL de enzima tripsina e 1 μL de papaína para cada macho). Com fórceps, transfira as glândulas acessórias a esta solução.
- Isolar a ponta das glândulas acessórias (contendo células secundárias) da parte proximal. Use fórceps fino para beliscar firmemente o meio de um lobo glandular e corte com a ponta afiada de um segundo fórceps. Retire a parte proximal das glândulas acessórias e o Ducto ejaculatório para melhorar a dissociação e reduzir o tempo de triagem celular.
Nota: Dissecando a parte distal de 20 pares de glândulas levará 15 a 20 min e digestão por peptidases, assim, começará à temperatura ambiente. - Depois que todas as pontas da glândula foram dissecadas, transfira-as em um tubo de 1,5 mL usando uma ponta especial do Pipet de 200 μL preparada na etapa 2.2.1. Deve ser largo, arredondado e molhado antes de segurar as glândulas.
Nota: Para o tecido da glândula acessório Pipet, as pontas devem sempre ser pre-molhadas com solução apropriada (enzima do trypsin ou SSM, mantem um tubo de cada para esta finalidade). Lave cuidadosamente as pontas entre as amostras para evitar contaminação.
4. digestão do tecido
- Coloque o microtubo em um agitador de 37 ° c por 60 min, balançando a 1.000 rpm.
Nota: A agitação e o tempo da digestão são críticos para a dissociação bem sucedida. A digestão mais curta ou imóvel dará a dissociação pobre, provavelmente porque a camada do músculo exterior e o líquido seminal viscoso interno protegem pilhas da glândula acessória dos peptidases. - Adicione 1 mL de SSM à temperatura ambiente para parar a digestão e prossiga imediatamente para o passo 5.
5. dissociação mecânica das células
- Usando uma ponta arredondada de 1.000 μL, pre-molhado com SSM, transfira a amostra a uma placa de 24 poços. Monitore a fluorescência de GFP o microscópio: a maioria de pontas da glândula devem olhar intact e alguns SC devem ser destacados.
- Usando uma ponta de Pipet estreita arredondada gerada na etapa 2.2.2, Pipet para cima e para baixo 3 a 5 vezes para interromper o tecido da glândula acessória.
Nota: Monitore a fluorescência para certificar-se de que os remendos grandes do tecido estiveram quebrados acima. Repita o passo 5,2 se este não for o caso. - Usando uma ponta de Pipet arredondada muito estreita (gerada na etapa 2.2.2), Pipet acima e para baixo 1-2 vezes.
Nota: Somente células individuais devem ser visíveis após a etapa 5,3. A utilização de placas de 24 poços é recomendada porque permitem uma monitorização fácil do processo. Quando algumas amostras foram processadas e deram resultado satisfatório (células secundárias de aparência saudável perfeitamente dissociadas), as etapas de pipetagem serão realizadas no microtubo. - Aguarde pelo menos 15 min para deixar as células se instalarem na parte inferior do poço e remover o excesso de SSM para reduzir o tempo de classificação.
Nota: Deixar as pilhas resolver provou superior aos métodos alternativos como a centrifugação, e permite uma última inspeção visual das pilhas apenas antes de FACS. - Pipet as células em um tubo limpo 1,5 mL e piscina amostras idênticas (dois lotes de 20 machos para cada condição). Enxague poços com SSM para recuperar as últimas células, e Pipet-los no tubo (use um pequeno volume).
- Em 1,5 mL de microtubos, adicione 300 μL de solução de lise celular e 1 μL de proteinase K [50 μg/μL] (soluções fornecidas no kit de purificação de RNA, consulte a etapa 7). Prepare dois tubos para cada amostra (uma para MCs e uma para SCs).
6. FACS (fluorescência-ativado célula de triagem)
- Adicionar marcador de viabilidade para cada amostra a ser classificado alguns minutos antes da triagem (0,3 mM Draq7).
Atenção: Draq7 deve ser manuseado com precaução. -
Classifique uma população homogênea de células secundárias ao vivo (células GFP-positivas, Draq7-negativas). Em outro microtubo, classifique uma população de células principais (menor, GFP negativo, células Draq7 negativas). Use a seguinte estratégia de gating FACS:
Nota: ajuste a pressão de classificador de células a 25 psi e passe as células através de um bocal de 100 μm. A taxa de classificação é de cerca de 2.000 células/s.- Exclua detritos e selecione células totais com base no FSC-SSC (Figura 2e) para excluir detritos.
- Exclua as células mortas. Excite Draq7 com um laser de 640 nanômetro e colete a fluorescência emitida com um filtro da faixa-passagem 795/70. Porta Draq7 células positivas (Figura 2F).
- Remova os doublets usando uma dupla gating em SSC-H vs SSC-W e FSC-A vs FSC-H (Figura 2h).
Nota: Exclua duplicações de células de forma estrita usando dupla gating, para reduzir a contaminação da célula principal. - Sort ~ 550 células GFP-positivas em um microtubo de 1,5 mL com tampão de Lise e proteinase K. Esta população é considerada células secundárias (SC, Figura 2G). Excite GFP em 488 nm e colete a fluorescência emitida com um filtro da faixa-passagem 526/52.
- Sort ~ 1.000 células GFP-negativas, homogêneas e pequenas em tamanho, em um microtubo de 1,5 mL com tampão de Lise e proteinase K. Esta população é considerada células principais (MC, Figura 2G).
- Vortex todas as amostras.
Nota: De 40 machos (~ 40 x 80 SC = 3.200 células secundárias), 600 a 800 células secundárias de singlet ao vivo são obtidas (cerca de 20-25% de recuperação). Pare de classificar em torno de 550 SC e 1.000 MC para normalizar amostras.
7. extração de RNA
Nota: Utilizamos o kit de purificação de RNA MasterPure da Epicentre para extração de RNA, com as seguintes adaptações. Outros kits podem ser usados enquanto o rendimento for alto o suficiente para preparar uma biblioteca para sequenciamento de ~ 500 células (2 ng RNAs foi usado aqui).
- Amostras de calor a 65 ° c por 15 min e Vortex a cada 5 min para completar a lise celular.
- Coloque as amostras no gelo por 5 min. siga as recomendações do fabricante para precipitações de ácidos nucleicos (partes "precipitação de ácidos nucleicos totais" e "remoção de DNA contaminante de preparações de ácidos nucleicos totais").
- Suspenda a pelota do RNA em 10 μL de tampão RNase-livre do TE.
- Adicionar inibidor de RNase (opcional).
- Armazene amostras em-80 ° c.
8. controles da qualidade da quantidade, da qualidade e da especificidade do RNA
- Estimar a qualidade e a concentração do RNA. Devido ao pequeno volume e concentração, use RNA 6000 chips pico aqui. O RNA da boa qualidade é definido como não-degradado, visível como uma baixa linha de base com picos afiados que correspondem a rRNAs.
-
RT-qPCR para controlar a identidade de células classificadas
- Realize a transcrição reversa com 2 ng de RNAs totais usando multi-hexâmeros aleatórios como primers. Execute RT no RNA secundário da pilha e no RNA principal da pilha.
Nota: cDNAs podem ser diluídas, aliquotadas e mantidas congeladas para uso posterior. - Realize o PCR quantitativo em tempo real usando pares apropriados da primeira demão para quantificar genes da limpeza (alfa-tubulin, 18S rRNA), genes específicos da pilha secundária (MSA, Rab19, Abd-B) e gene específico da pilha principal (peptide do sexo).
- Realize a transcrição reversa com 2 ng de RNAs totais usando multi-hexâmeros aleatórios como primers. Execute RT no RNA secundário da pilha e no RNA principal da pilha.
9. sequenciamento (preparação da biblioteca do cDNA, sequenciamento e análise de dados)
- Use 2 ng de RNAs totais para sintetizar cDNAs com primers polydT. Use a tecnologia SMARTer para amplificá-los para amplificação.
- Use um kit NextEra XT para preparar a biblioteca.
- Seqüência usando multiplexado, 100 nucleotídeos single lê seqüenciamento (embora 50 nucleotídeos leituras são apropriadas para a maioria dos fins) para produzir cerca de 30 milhões leituras para cada amostra.
10. análise de dados
- Execute FastQC.
- Use o alinhador Star para mapear as leituras no genoma de referência da Drosophila dm6 UCSC e gerar arquivos. bam. Use o Visualizador de genômica Integrativa (IGV) para visualizar leituras no navegador do genoma.
- Use HTSeq para executar contagens de genes.
- Use o método de média aparada de valores M (TMM) para normalizar as contagens de genes22. Use edgeR para realizar análises estatísticas de expressão diferencial, parcelas MA e PCA.
- Para análise e estatística da expressão gênica, use o modelo linear geral, o teste F de quase-verossimilhança com taxa de detecção falsa (FDR) e benjamini & correção de Hochberg (BH).
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Representative Results
O protocolo aqui apresentado permite que um experimentador Isole as células secundárias das glândulas acessórias masculinas da Drosophila e EXTRAIA seu RNA no decorrer de um único dia (Figura 1).
Utilizamos a construção de Abd-B-GAL4 18 para rotular células secundárias (SC), mas não as células principais (MC) com GFP (Figura 2a). Um objetivo deste procedimento é obter o transcriptoma tipo selvagem de SCs (o tipo selvagem é escrito com vírgulas invertidas, uma vez que são obtidos a partir de moscas transgênicas expressando GFP e GAL4). Outro objetivo é obter o RNA SC através de um procedimento rápido e fácil que permita estudar sua expressão gênica em diferentes condições. Assim, realizamos este procedimento usando o tipo Wild e os mutantes "IAB-6cocuD1" que carregam um apagamento de 1,1 KB removendo o potenciador de Abd-B responsável pela expressão de SC. Esta supressão também remove o promotor da MSA, uma transcrição importante para o desenvolvimento de células secundárias, morfologia e função18,20 (Figura 2B, C). Este protocolo foi repetido três vezes com 2 genótipos para obtenção de triplicados biológicos (doravante denominados WT-1,-2,-3 para o tipo Wild e D1-1,-2 e-3 para o IAB-6cocuD1).
Este protocolo permite a dissociação de MC e SC de glândulas acessórias de Drosophila em poucas horas (Figura 2D). Ambas as populações de células são então classificadas em dois tubos diferentes para isolar MCs e SCs. A estratégia de gating para FACS é mostra na Figura 2E-2G. Draq7 permite estimar a viabilidade celular em torno de 70% para toda a amostra (Figura 2F). Os camisolas representam mais de 90% da população do SC, e mais de 80% da população de MC, estimada pelo FSC-A vs FSC-h e SSC-h vs SSC-W. (ver Figura 2H). Isso reflete uma dissociação eficiente. Cerca de 10% dos eventos de triagem foram anuladas porque outra célula ou detritos estavam presentes na mesma gota de FACS. De 40 machos, nós coletamos tipicamente 550 SCs e 1.000 MCs e interrompemos então a classificação. A partir de 1 amostra (de 6), não foi possível chegar a 550 células secundárias. A amostra de WT-1 foi obtida assim de somente 427 SC mas forneceu o RNA da qualidade e da quantidade similares como outro.
As células são classificadas em tampão de lise (contendo proteinase K). Assim que todas as amostras estiverem prontas, as RNAs são extraídas de cada amostra de células, a fim de ter pelotas de RNA no final do dia. A qualidade e a quantidade de RNAs são estimadas usando um Bioanalyzer com um chip apropriado para lidar com baixas concentrações e pequenos volumes. Como as concentrações estimadas foram variáveis entre as amostras (variando de mais de 1.300 PG/μL até 344 PG/μL, ver Figura 3a), ajustamos o material de partida para a síntese da biblioteca RT-qPCR e cDNA para aproximadamente 2 ng (medido concentrações não são altamente precisas). Nós quantificamos a expressão de genes específicos por qPCR em tempo real em extratos de tipo selvagem MC e SC para controlar a identidade das populações de células que nós ordenamos. Figura 3 B mostra a expressão gênica como quantificações relativas normalizadas à expressão de alfa-tubulina . Os genes da limpeza como o rRNA 18s e o alfa-tubulin são detectados em todas as amostras, como esperado. Completamente o contrário, o gene Rab19 do SC é detectado somente dos extratos do SC, e o peptide do sexo do gene de MC é detectado somente do MC. Nós anotamos que a expressão Rab19 no SC do mutante de IAB-6cocuD1 é baixa relativa ao tipo selvagem SC, sugerindo que a expressão deste gene esteja afetada pela perda de Abd-B e de MSA (consistentemente, o grande Rab19-rotulados vacúolos são perdidos no IAB-6cocuD1 mutante21). O Transcript secundário pilha-específico MSA é detectado somente do tipo selvagem SC e não do MC, nem do IAB-6cocuD1 SCs, que era esperado desde que o promotor de MSA é suprimido neste mutante. Ao todo, os QCs mostrados na Figura 3 demonstram que as RNAs obtidas através deste protocolo não são degradadas, e que ambas as populações de células (SC e MC) são classificadas com sucesso a partir de glândulas acessórias, tanto no tipo selvagem quanto nas condições mutantes. Somente as células secundárias ' RNAs foram sequenciadas aqui, mas note que este procedimento permite o perfil concomitante do transcriptoma de SCs e de MCS.
O RNA-seqüenciamento foi realizado usando procedimentos padrão. Aqui, só Discutiremos as análises de controle de qualidade pertinentes para o propósito deste método. Quando as sequências são obtidas, as leituras são mapeadas para o genoma da Drosophila de referência, atribuída aos genes e normalizadas. A PCA (análise de componentes principais) foi realizada nas 6 amostras (3 tipo Wild e 3 IAB-6cocuD1 repetições). Como grande parte da variabilidade nos dados possível é contabilizada no PC1, e como grande parte da variabilidade restante é contabilizada no PC2. Como mostrado na Figura 4a, o tipo Wild Replica o cluster fechar juntos e longe de amostras IAB-6cocuD1 . Isso mostra que as amostras de WT são mais semelhantes umas às outras do que as de mutantes. Isto ilustra a reprodutibilidade do método e sua habilidade de detectar o programa genético anormal das pilhas secundárias do mutante. Enquanto as amostras D1-2 e D1-3 se aglomeram juntas, notamos que a amostra D1-1 é bastante divergente. Uma vez que todos os QCs para esta réplica são bons e comparáveis a todas as outras repetições, podemos excluir um problema de preparação da amostra (29 milhões leituras no total, > 76% dos quais se alinham exclusivamente ao genoma de referência. Entre esses, > 77% são atribuídos a um gene, > 90% são mRNAs e < 3% são rRNA). Essa divergência pode refletir que a expressão gênica em SC é instável no IAB-6cocuo, embora o teste dessa hipótese exija mais repetições.
Visualizar leituras alinhadas a genes específicos no genoma permite uma estimativa Visual da qualidade dos dados. A Figura 4 mostra uma seleção de genes, com leituras de 1 repetição representativa para cada genótipo. Não surpreendentemente, os genes de limpeza como Act5C são expressos em ambos os genótipos (Figura 4B), bem como os genes SC- específicos Rab19 e DVE (Figura 4C, D). A falta de leituras intronic confirma que polydT seletivamente aprontou a transcrição reversa dos mRNAs ememenados maduros para a preparação da biblioteca do cDNA. Notavelmente, podemos ver variações importantes e significativas na expressão de genes específicos entre o tipo selvagem e o IAB-6cocuD1 SC. Isso é exemplificado na Figura 4E pelo gene MSA , cuja expressão forte no tipo Wild é perdida no IAB-6cocuD1. MSA é apresentado como uma prova do princípio que este método permite identificar os genes que são mis-regulado em condições do mutante. Isto ajudará a compreender os fenótipos observados neste mutante, e pôde dar introspecções novas em funções secundárias normais das pilhas.
Figura 1: visão geral do protocolo. As etapas principais do protocolo são mostradas, com a linha do tempo no lado direito. Este procedimento permite que um começando com Drosophila ao vivo na parte da manhã para ter dissociada células da glândula acessória ao meio-dia, classificá-los com base na expressão GFP, e obter seus RNAs extraídos até o final do dia de trabalho. Sequenciamento de RNA e análise de dados normalmente levará algumas semanas. Este valor foi modificado a partir da referência27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: isolando e classificando células secundárias expressando GFP. (A) imagem Confocal da glândula acessória de Abd-b: GAL4 UAS-GFP expressando GFP em células secundárias (SC), mas não nas células principais (MC). Os núcleos são manchados com DAPI (azul). Linha branca pontilhada delimita lobes AG. ED é o Ducto ejaculatório. As barras brancas no canto superior esquerdo são escalas de 50 μm. (B,C) Vistas ampliadas da parte distal da glândula acessória com SC expressando GFP, em antecedentes de tipo selvagem (B) e IAB-6cocuD1 (C). (D) células dissociadas em baixa ampliação o binóculo GFP. (E-H) FACS estratégia de gating para purificar SC e MC. pontos vermelhos em todos os painéis mostrados SCs como definido no painel (G). Primeiramente os restos são excluídos (E, etapa 6.2.1) assim como as pilhas inoperantes positivas de draq-7 (F, etapa 6.2.2). As células positivas do GFP são selecionadas (SC), bem como uma população homogênea de células negativas da GFP (MC) (G, Steps 6.2.4 e 6.2.5). Os doublets são excluídos da população de MC e de SC (etapa 6.2.3, somente o SSC-H vs SSC-W que gating para o SC é mostrado em 2h como um exemplo). Este valor foi modificado a partir da referência27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: QC em RNAs: qualidade, quantidade e especificidade do tipo de célula. (A) controle da qualidade do RNA e estimativa de concentração no picochip. O pico de 25 NT é o controle para quantificação. A baixa linha de base indica baixa degradação e os 2 picos principais são os RNAs ribossômicos. As 3 amostras utilizadas para RT-qPCR são mostradas, sua qualidade é representativa de todas as amostras de RNA utilizadas neste estudo, e suas concentrações estimadas refletem a variação no RNA total obtido entre as amostras. (B) RT-qPCR demonstram a especificidade da triagem de células secundárias (SC) e células principais (MC). A quantificação da expressão gênica é feita usando a fórmula q = 2(40-CQ) . Cada triplicado de cada gene em cada circunstância é normalizado à quantidade média de RNA do alfa-tubulin para compensar a variação total do RNA. As barras de erro mostram o desvio padrão. WT significa tipo selvagem e D1 refere-se ao mutante IAB-6cocuD1 . Este valor foi modificado a partir da referência27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: QC em dados de sequenciamento de RNA. (A) análise de componentes principais (PCA) nos conjuntos de dados de sequenciamento de RNA WT-1,-2,-3 (pontos verdes) e D1-1,-2,-3 (pontos azuis). (B-E) Seqüenciamento de leituras mapeadas para o genoma de referência da Drosophila usando o software IGV. Somente uma amostra representativa de cada genótipo é mostrada para a causa da claridade (WT-1 e D1-2), e somente alguns Locus específicos são mostrados. Os nomes dos genes são escritos em cima de cada painel, > e < símbolos referem-se à sua orientação. Os números entre parênteses representam para cada faixa a escala para o número de leituras por par de base de DNA. Esta escala é a mesma para ambas as condições para um determinado Gene, mas varia entre os genes para uma melhor visualização. As barras azuis na parte inferior de cada painel mostram os íntrons dos genes (linha fina), os exons (linha larga) e o ORF (retângulos com > >). Note-se que Rab19 e Arl5 são sobreposição, genes convergentes (C). Este valor foi modificado a partir da referência27. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primers utilizados para RT-qPCR neste estudo: | ||
| Gene alvo | Iniciador dianteiro | Primer reverso |
| Alfa-tubulina | TTTTCCTTGTCGCGTGTGAA | CCAGCCTGACCAACATGGAT |
| 18S rRNA | O CTGAGAAACGGCTACCACATC | ACCAGACTTGCCCTCCAAT |
| Rab19 | CAGGAGAGGTTTCGCACTATTAC | O TTGGAAAAGGAAGACCGCTTG |
| Peptídeo sexo | GGAATGGCCGTGGAATAGGA | TAACATCTTCCACCCCAGGC |
| Msa | CTCATCTGCGTCTTCGCGTG | CAGCTCCGTTTGTAATCTCTCGAGC |
Tabela 1: sequência de primers
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Discussion
Os métodos para a dissociação da pilha do tecido da Drosophila como discos imaginal são descritos já23. Nossas tentativas de simplesmente usar esses procedimentos em glândulas acessórias falharam, incentivando-nos a desenvolver este novo protocolo. A digestão da protease e a trituração mecânica foram passos críticos para o sucesso do procedimento e, assim, colocamos muitas anotações nas seções 2 a 5 para ajudar os experimentadores a obter resultados satisfatórios. Para que a dissociação seja bem-sucedida, as peptidases devem atingir as células da glândula acessória, que são protegidas pelo fluido seminal viscoso no lúmen e a camada muscular ao redor da glândula. A dissecação da parte distal das glândulas foi, portanto, crítica (etapa 3,6). Também, digerindo por 60 min pelo menos com agitação vigorosa (etapa 4,1) era necessário. A dissociação delicada com solução do tripsina (por exemplo, tryple) preservou a integridade da glândula e a viabilidade da pilha até a dissociação mecânica. A adição de papaína ou colagenase em associação com a solução de tripsina melhorou a dissociação (a dissociação perfeita foi obtida com menos pipetagem, resultando em melhor sobrevida celular). No entanto, nenhuma dessas enzimas foram suficientes para dissociar as células por conta própria. A pipetagem com pontas estreitas arredondadas geradas na parte 2.2.2 é um passo fundamental para este método. Portanto, esta trituração (etapas 5.2-5.3) deve ser otimizado em experimentos de pequena escala para escolher a melhor combinação de dicas (ver nota na etapa 5,3).
Usando este protocolo, um será capaz de isolar 500 para 800 células secundárias ao vivo de 40 machos. Isso representa ~ 20% (± 5%) recuperação considerando 3.200 SC como o material de partida (40 machos x 80 SC). a eficiência de 20% era alta bastante para arranjar em seqüência do RNA desde que nós poderíamos processar amostras múltiplas em um dia. No entanto, isso pode ser melhorado por vários métodos, incluindo: trabalhar em lotes maiores; fazendo a trituração no tubo da digestão e saltando a etapa 5,4 para reduzir transferências; triturando muito suavemente (algumas células GFP + dissociadas morrem logo após o passo 5,3); encurtamento do período entre dissociação e FACS; diminuindo o tempo de digestão usando solução de tripsina em maior concentração; usando parâmetros menos rigorosos para seleção de singlet (etapa 6.2.3) e classificação anulada. Uma limitação deste protocolo é que leva várias horas para isolar as células; daqui não é serido para estudar mudanças muito transientes da expressão de Gene. Com este protocolo, 4 x 20 machos podem ser processados por uma única pessoa (com treinamento) em uma manhã, permitindo a extração do RNA do SC de duas circunstâncias diferentes em 1 dia (Figura 1). Notavelmente, mais experimentadores podem participar da coleta de glândulas acessórias (etapas 3.1-3.3), a fim de processar várias amostras no mesmo dia. No entanto, as etapas 3,4 em diante serão preferencialmente executadas pela mesma pessoa para maximizar a reprodutibilidade.
As células secundárias realizam funções essenciais para a fecundidade masculina12,20,24, mas o quadro completo dos genes que expressam para cumprir esse papel ainda está faltando. Aqui, nós descrevemos como obter o transcriptoma destas pilhas de um número relativamente pequeno de moscas, permitindo a comparação da expressão de Gene no SC em circunstâncias diferentes. Aqui, um mutante que afeta a função e a morfologia do SC foi usado, e as mudanças importantes em seu transcriptoma são visíveis. Este método pôde assim ajudar a identificar os genes novos do SC necessários para sua função. A nosso conhecimento, o único método alternativo para obter o transcriptoma do SC foi executado em nosso laboratório pela colheita manual de SCs. os dados de sequenciamento de RNA de boa qualidade foram obtidos, mas o procedimento foi muito trabalhoso para ser realizado em múltiplas condições. Compararemos nossos conjuntos de dados do SC RNAseq e analisaremos seu significado biológico sobre a biologia do SC em um papel distinto (em preparação).
No futuro, esta técnica não só derramará luz sobre o transcriptome selvagem do tipo SC, mas também permitirá estudar o impacto do ambiente ou alteração genética no transcriptome das células das glândulas acessórias. O número SC, a morfologia e o conteúdo vacuolar têm demonstrado depender da dieta masculina, do estado de acasalamento e da idade21,25,26. Nós ainda temos uma compreensão limitada das vias genéticas envolvidas e comparando transcriptoma SC em diferentes condições seria perspicaz. Este protocolo rápido e relativamente simples permitirá tais estudos. Importante, este método permite isolar as células principais dos mesmos indivíduos, e poderia assim ser usado como é para determinar se os parâmetros genéticos e ambientais afetam ambos os tipos de células de glândula acessória simultaneamente.
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Disclosures
Os autores não têm divulgação.
Acknowledgments
Nós somos gratos aos membros do laboratório de Karch, ao plateform da genômica de iGE3, à facilidade do núcleo da citometria do fluxo da Universidade de Genebra, e ao Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye que ajustou o protocolo para FACS. Agradecemos Luca Stickley por sua ajuda com a visualização das leituras sobre IGV. Agradecemos-nos por uma gentil permissão para reutilizar figuras, e os editores para nos pedir para ser criativo com a escrita.
Esta pesquisa foi financiada pelo estado de Genebra (CI, RKM, FK), o fundo nacional suíço de pesquisa (www.snf.ch) (FK e RKM) e doações da Fundação Claraz (FK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μL graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μL bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
