Multi-fiber fotometri å Record neural aktivitet i fritt bevegelige dyr
Summary
Denne protokollen detaljer hvordan å implementere og utføre multi-fiber fotometri innspillinger, hvordan å korrigere for kalsium-uavhengige gjenstander, og viktige hensyn for dual-Color fotometri Imaging.
Abstract
Registrering av aktiviteten til en gruppe neurons i et fritt bevegelig dyr er en utfordrende oppgave. Videre, ettersom hjernen er dissekert i mindre og mindre funksjonelle undergrupper, blir det avgjørende å ta opp fra anslag og/eller genetisk definerte subpopulasjoner av neurons. Fiber fotometri er en tilgjengelig og kraftfull tilnærming som kan overvinne disse utfordringene. Ved å kombinere optiske og genetiske metoder, kan neural aktivitet måles i dype hjernens strukturer ved å uttrykke genetisk kodet kalsium indikatorer, som oversetter nevrale aktivitet til et optisk signal som lett kan måles. Den nåværende protokollen detaljer komponentene i en multi-fiber fotometri system, hvordan få tilgang til dype hjernens strukturer for å levere og samle lys, en metode for å ta høyde for bevegelse artefakter, og hvordan å behandle og analysere fluorescerende signaler. Protokollen detaljer eksperimentelle betraktninger når du utfører enkel og dobbel farge Imaging, fra enten én eller flere implantert optiske fibre.
Introduction
Evnen til å koordinere nevrale reaksjoner med spesifikke aspekter av et dyrs atferd er avgjørende for å forstå rollen en bestemt gruppe neurons spiller i regi eller svare på en handling eller stimulans. Gitt kompleksiteten av animalsk atferd, med myriade av interne stater og eksterne stimuli som kan påvirke selv de enkleste av handlinger, innspilling et signal med én prøve oppløsning utstyrer forskere med de nødvendige verktøy for å overvinne disse Begrensninger.
Fiber fotometri har blitt den teknikken for valg for mange forskere innen systemer nevrovitenskap på grunn av sin relative enkelhet i forhold til andre in vivo opptaks teknikker, den høye signal-til-støy-forhold, og evnen til å spille inn i en rekke Behavioral paradigmer1,2,3,4,5,6,7,8. I motsetning til tradisjonelle elektrofysiologisk metoder, er fotometri den optiske tilnærmingen som oftest brukes sammen med genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs endre deres evne til å fluorescerer basert på om de er bundet til kalsium eller ikke. Fordi den interne konsentrasjonen av kalsium i neurons er svært tett regulert og spenning-gated kalsiumkanaler åpne når en Nevron branner en handling potensial, forbigående økning i indre kalsium konsentrasjon, noe som resulterer i forbigående økninger i evne til en GECI til fluorescens, kan være en god proxy for neuronal avfyring9.
Med fiber fotometri, eksitasjon lys er rettet ned en tynn, multimode optisk fiber inn i hjernen, og et utslipps signal er samlet tilbake opp gjennom samme fiber. Fordi disse optiske fibrene er lette og bøyelig, kan et dyr bevege seg stort sett uhindret, noe som gjør denne teknikken kompatibel med et bredt spekter av atferds tester og forhold. Noen forhold, for eksempel raske bevegelser eller bøying av fiberoptisk patch ledningen utover radius der den kan opprettholde total intern refleksjon, kan innføre signal artefakter. For å entydighetsoperatoren signal fra støy, kan vi utnytte en egenskap av GCaMP kjent som “isosbestic punkt.” Kort, med GCaMP, som Bølgelengden av eksitasjon lyset er forskjøvet til venstre, dens utslipp i kalsium-bundet tilstand avtar og utslipp i kalsium-ubundet tilstand marginalt øker. Poenget der den relative intensiteten av disse to utslippene er likeverdige kalles isosbestic punktet. Når GCaMP er spent på dette punktet, er dens utslipp upåvirket av endringer i interne kalsium konsentrasjoner, og variasjonen i signalet er oftest på grunn av demping av signalet fra overbending av fiberoptisk patch ledningen eller bevegelse av nevrale vev i forhold til implantert fiber.
Single enhet elektrofysiologi er fortsatt gullstandarden for fritt-bevegelige in vivo innspillinger på grunn av sin single-celle og Single-Spike nivå oppløsning. Imidlertid, den kan vanskelig å finne det molekylær sammenfalle av cellene tilværelse registrert, og det stolpe-hoc analyse kan helt arbeidskrevende. Mens fiber fotometri ikke har en enkelt celle oppløsning, gjør det at forskerne å stille spørsmål umulig å ta opp med tradisjonelle teknikker. Kombinere viral strategier med transgene dyr, kan uttrykket av GECIs rettes til genetisk definerte neuronal typer til posten befolkning-eller projeksjon-definert neural aktivitet, som kan utføres ved å overvåke kalsium signal direkte på axon terminaler10,11. Videre, ved å implanting flere fiberoptiske kanyler, er det mulig å samtidig overvåke neural aktivitet fra flere hjerneregioner og stier i samme dyr12,13.
I dette manuskriptet beskriver vi en teknikk for single og multi-fiber fotometri, hvordan du korrigerer for kalsium-uavhengige artefakter, og detalj hvordan du utfører mono-og dual-Color innspillinger. Vi gir også eksempler på spørsmål som gjør det mulig for en å spørre og deres økende grad av kompleksitet (se figur 1). Fiber fotometri oppsett for multi-fiber innspillinger beskrevet i denne protokollen kan bygges ved hjelp av en liste over materialer som finnes på https://sites.google.com/view/multifp/hardware (figur 2).
Det er viktig at systemet er utstyrt for både 410 NM og 470 NM eksitasjon bølgelengder for kalsium-uavhengige og kalsium-avhengige fluorescens utslipp fra GCaMP6 eller dens varianter. For Custom-bygget oppsett eller hvis det ikke er tilgjengelig programvare for å kjøre systemet, gratis, åpen kildekode-program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) kan brukes. Alternativt kan fiber fotometri kjøres gjennom MATLAB (f. eks https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller andre programmeringsspråk14. Programvaren og maskinvaren i systemet bør tillate manipulering av både 410 NM og 470 NM lysdioder og kameraet, utvinning av bilder (figur 2), og beregning av gjennomsnittlig fluorescerende intensitet i regionene av interesse (ROIs) trukket rundt fibrene på bildene. Utdataene bør være en tabell med gjennomsnittlig intensitet verdier registrert med 470 NM og 410 NM lysdioder fra hver fiber i patch ledningen. Når du utfører multi-fiber eksperimenter, kan 400 μm med følgende fibre begrense bevegelsen av mus. I slike tilfeller anbefaler vi å bruke 200 μm patch ledninger, som gir mer fleksibilitet. Det kan også være mulig å bruke mindre dummy kabler under trening av mus.
Det er avgjørende å kunne trekke ut tid poeng for hendelser av interesse under fiber fotometri oppkjøp. Hvis systemet ikke lett gir et innebygd system for å integrere TTLs for spesifikke hendelser, er en alternativ strategi å tildele en tidsangivelse til individuelle tidspunkt som er registrert for å samsvare med bestemte tider og hendelser under eksperimentet. Time stempling kan gjøres ved hjelp av datamaskinen klokken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiber fotometri er en tilgjengelig tilnærming som gjør at forskerne kan registrere bulk-kalsium dynamikk fra definerte neuronal populasjoner i fritt bevegelige dyr. Denne metoden kan kombineres med et bredt spekter av atferds tester, inkludert “Movement Heavy” oppgaver som tvang svømme tester2, frykt-condition18, sosiale interaksjoner1,4, og andre7, 8<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) til CP C. P. er en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi takker også Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) for produksjon av viral vektorer som brukes i denne studien.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
