Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Summary

Este protocolo detalha como aplicar e executar gravações da fotometria da multi-fibra, como corrigir para artefatos cálcio-independentes, e considerações importantes para a imagem latente da fotometria da duplo-cor.

Abstract

Registrar a atividade de um grupo de neurônios em um animal em movimento livre é uma empresa desafiadora. Além disso, como o cérebro é dissecado em subgrupos funcionais menores e menores, torna-se primordial para gravar a partir de projeções e/ou subpopulações geneticamente definidas de neurônios. A fotometria de fibras é uma abordagem acessível e poderosa que pode superar esses desafios. Combinando metodologias ópticas e genéticas, a atividade neural pode ser medida em estruturas cerebrais profundas, expressando indicadores de cálcio geneticamente codificados, que traduzem a atividade neural em um sinal óptico que pode ser facilmente medido. O protocolo atual detalha os componentes de um sistema da fotometria da multi-fibra, como alcançar estruturas profundas do cérebro para entregar e recolher a luz, um método para dar conta dos artefatos do movimento, e como processar e analisar sinais fluorescentes. O protocolo detalha considerações experimentais ao executar a imagem latente única e dupla da cor, de único ou de fibras óticas implantadas múltiplas.

Introduction

A capacidade de correlacionar respostas neurais com aspectos específicos do comportamento de um animal é fundamental para entender o papel que um determinado grupo de neurônios desempenha em dirigir ou responder a uma ação ou estímulo. Dada a complexidade do comportamento animal, com a miríade de Estados internos e estímulos externos que podem afetar até mesmo as ações mais simples, o registro de um sinal com resolução de julgamento único equipa pesquisadores com as ferramentas necessárias para superar esses Limitações.

A fotometria da fibra transformou-se a técnica da escolha para muitos investigadores no campo da neurociência dos sistemas por causa de sua simplicidade relativa comparada a outras técnicas in vivo da gravação, sua relação sinal-à-ruído elevada, e a habilidade de gravar em uma variedade de paradigmas comportamentais^{1,2,3,4,5,6,7,8.} Diferentemente dos métodos eletrofisiológicos tradicionais, a fotometria é a abordagem óptica mais comumente utilizada em conjunto com indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs, a série GCaMP)⁹. GECIS mudar a sua capacidade de fluorescência com base em se eles estão ou não ligados ao cálcio. Porque a concentração interna de cálcio nos neurônios é muito firmemente regulada e tensão-gated canais de cálcio aberto quando um neurônio dispara um potencial de ação, aumentos transitórios na concentração interna de cálcio, que resultam em aumentos transitórios no capacidade de um GECI para fluorescência, pode ser um bom proxy para o disparo neuronal⁹.

Com a fotometria da fibra, a luz da excitação é dirigida abaixo de uma fibra ótica fina, multimodo no cérebro, e um sinal de emissão é coletado para trás acima através da mesma fibra. Porque estas fibras ópticas são leves e bendable, um animal pode mover-se pela maior parte Unhindered, fazendo esta técnica compatível com uma disposição larga de testes e de circunstâncias comportáveis. Algumas condições, tais como movimentos rápidos ou flexão do cabo de remendo de fibra óptica além do raio em que pode manter a reflexão interna total, podem introduzir artefatos de sinal. Para ambiguar sinal de ruído, podemos explorar uma propriedade do GCaMP conhecido como o “ponto isosbestic.” Momentaneamente, com GCaMP, porque o comprimento de onda da luz da excitação é deslocado à esquerda, sua emissão no estado cálcio-ligado diminui e a emissão no estado cálcio-unbound aumenta marginalmente. O ponto em que a intensidade relativa destas duas emissões são iguais é denominado o ponto espécies. Quando GCaMP é excitado neste momento, sua emissão é afetada por mudanças em concentrações internas do cálcio, e a variação no sinal é o mais frequentemente devido à atenuação do sinal do overdobra do cabo de remendo Fiber-Optic ou do movimento do tecido neural em relação à fibra implantada.

A electrofisiologia da única unidade é ainda o padrão do ouro para livremente-mover-se em gravações in vivo devido a sua única-pilha e única-espiga resolução nivelada. No entanto, pode ser difícil identificar a identidade molecular das células que estão sendo gravadas, e a análise post-hoc pode ser bastante trabalhosa. Quando a fotometria da fibra não tiver a definição da único-pilha, permite investigadores de fazer perguntas impossíveis endereçar com técnicas tradicionais. Combinando estratégias virais com animais transgênicos, a expressão de GECIs pode ser direcionada para tipos neuronais geneticamente definidos para registrar a atividade neural definida pela população ou projeção, que pode ser realizada pelo monitoramento do sinal de cálcio diretamente no AXON terminais^10,11. Além disso, através da implantação de múltiplas cânulas de fibra óptica, é possível monitorar simultaneamente a atividade neural de várias regiões cerebrais e caminhos no mesmo animal^12,13.

Neste manuscrito, nós descrevemos uma técnica para a fotometria single e multi-Fiber, como corrigir para artefatos cálcio-independentes, e detalhar como executar gravações mono e Dual-Color. Nós também fornecemos exemplos dos tipos de perguntas que ele permite que alguém pergunte e seus níveis crescentes de complexidade (veja a Figura 1). A configuração de fotometria de fibra para gravações de várias fibras detalhadas neste protocolo pode ser construída usando uma lista de materiais encontrados em https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figura 2).

É essencial que o sistema esteja equipado para comprimentos de onda da excitação de 410 nanômetro e de 470 nanômetro para a emissão cálcio-independente e cálcio-dependente da fluorescência de GCaMP6 ou de suas variações. Para configurações personalizadas ou se não houver nenhum software disponível para executar o sistema, o livre, programa de código aberto bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) pode ser usado. Alternativamente, a fotometria da fibra pode ser executada através de MATLAB (por exemplo, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)¹² ou a outra língua de programação¹⁴. O software e hardware do sistema deve permitir a manipulação de ambos os 410 nm e 470 nm LEDs e a câmera, extração de imagens (Figura 2), e cálculo da intensidade média fluorescente nas regiões de interesse (Rois) desenhado em torno das fibras em as imagens. A saída deve ser uma tabela de valores médios de intensidade registradas com os LEDs 470 nm e 410 nm de cada fibra no cabo de remendo. Ao realizar experimentos Multifibras, 400 μm de fibras podem limitar o movimento de camundongos. Nesses casos, recomendamos o uso de cabos de remendo de 200 μm, que proporcionam mais flexibilidade. Também pode ser possível usar cabos fictícios menores durante o treinamento de camundongos.

É crucial poder extrair pontos do tempo para eventos do interesse durante a aquisição da fotometria da fibra. Se o sistema não fornecer prontamente um sistema interno para integrar TTLs para eventos específicos, uma estratégia alternativa é atribuir um carimbo de data/hora a pontos de tempo individuais gravados para alinhar com horários e eventos específicos durante o experimento. O carimbo de tempo pode ser feito usando o relógio do computador.

Protocol

Todos os experimentos foram feitos de acordo com os comitês institucionais de cuidados e uso de animais da Universidade da Califórnia, San Diego, e o guia canadense para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pela Université Laval proteção animal Comité. 1. alinhamento do trajeto ótico entre a câmera do CMOS (semicondutor complementar do óxido de metal) e o cabo de remendo individual ou ramificando Afrouxe todos os parafusos no Tradutor de 5 eixos (11, …

Representative Results

Correlações neurais de respostas comportamentais podem variar dependendo de uma variedade de fatores. Neste exemplo, utilizou-se a fotometria de fibra in vivo para medir a atividade dos terminais AXON da área hipotálamo lateral (LHA) que terminam no habenula lateral (LHb). Camundongos tipo Wild foram injetados com um vírus adeno-associado (AAV) codificando GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) na LHA e uma fibra óptica foi implantada com a ponta imediatamente acima do LHb (Figura 4a</stro…

Discussion

A fotometria da fibra é uma aproximação acessível que permita que os investigadores gravem a dinâmica do volume-cálcio das populações neuronal definidas em animais livre-moventes. Este método pode ser combinado com uma ampla gama de testes comportamentais, incluindo tarefas de “movimento pesado”, como testes de natação forçada², Fear-condicionamento¹⁸, interações sociais^1,4e outros^7</…

Materials

1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long	Thorlabs	SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long	Thorlabs	SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long	Thorlabs	SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable	Thorlabs	M59L01
12.7 mm Optical Post	Thorlabs	TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder	Thorlabs	PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube	Thorlabs	KPS101
20x objective	Thorlabs	RMS20X	#10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount	Thorlabs	CM1-DCH/M	#8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED	Doric Lenses	CLED_405	#2 in Figure 2
410 nm bandpass filter	Thorlabs	FB410-10	#5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED	Doric Lenses	CLED_465	#1 in Figure 2
470 nm bandpass filter	Thorlabs	FB470-10	#4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter	Semrock	FF01-560/14-25	#5 in Figure 5
560 nm LED	Doric Lenses	CLED_560	#1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount	Thorlabs	K5X1	#11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet	Thorlabs	AC254-035-A-ML	#7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator	Thorlabs	AD11F	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator	Thorlabs	AD127-F	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB1824
Clamping Fork	Thorlabs	CF125
Cube connector	Thorlabs	CM1-CC
Dual 493/574 dichroic	Semrock	FF493/574-Di01-25×36	#10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6	Semrock	FF01-535/22-25	#6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels	Thorlabs	XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining	Thorlabs	SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder	Thorlabs	SM1QP	#4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light	Thorlabs	F671SMA-405	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light	Thorlabs	F240SMA-532	#3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter	Semrock	FF01-520/35-25	In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera	Thorlabs	DCC3260M	#13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter	Neurophotometrics	SPLIT	#14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff	Thorlabs	DMLP425R	#8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff	Semrock	FF495-Di03	#9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement	C&B
M8 – M8 cable	Doric Lenses	Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas	Doric Lenses		Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords	Doric Lenses		Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter	Semrock	FF01-600/37-25	In light beam splitter
T7 LabJack	LabJack
T-cube LED Driver	Thorlabs	LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240	Thorlabs	CAB-DCU-T3