자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 광도 측정법
Summary
이 프로토콜은 다중 섬유 광도 측정 기록을 구현하고 수행하는 방법, 칼슘 독립적 인 아티팩트를 수정하는 방법 및 이중 색상 광도계 이미징에 대한 중요한 고려 사항을 자세히 설명합니다.
Abstract
자유롭게 움직이는 동물에서 뉴런 그룹의 활동을 기록하는 것은 어려운 일입니다. 더욱이, 두뇌는 더 작고 더 작은 기능 적인 하위 그룹으로 해부되기 때문에, 뉴런의 투영 및/또는 유전적으로 정의된 하위 집단에서 기록하는 것이 가장 중요하게 됩니다. 섬유 광도 측정은 이러한 문제를 극복할 수 있는 접근가능하고 강력한 접근 방식입니다. 광학 및 유전 적 방법론을 결합하여, 신경 활동은 쉽게 측정 할 수있는 광학 신호로 신경 활동을 변환 유전자 부호 칼슘 지표를 표현하여 깊은 뇌 구조에서 측정 할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 다중 섬유 광도 계열 시스템의 구성 요소, 빛을 전달하고 수집하는 깊은 뇌 구조에 액세스하는 방법, 모션 아티팩트를 설명하는 방법, 형광 신호를 처리하고 분석하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 단일 또는 다중 이식된 광섬유에서 단일 및 이중 컬러 이미징을 수행할 때 실험적 고려 사항을 자세히 설명합니다.
Introduction
동물의 행동의 특정 측면과 신경 반응을 상관 시키는 능력은 특정 신경 세포 의 특정 그룹 지시 또는 행동 또는 자극에 응답에 재생 하는 역할을 이해 하는 데 중요 하다. 동물 행동의 복잡성을 감안할 때, 가장 간단한 행동에도 영향을 미칠 수있는 수많은 내부 상태와 외부 자극을 감안할 때, 단일 시험 해상도로 신호를 기록하면 연구원이 이를 극복하는 데 필요한 도구를 갖추게됩니다. 제한.
섬유 광도계는 다른 생체 내 기록 기술과 비교하여 상대적으로 단순성, 높은 신호 대 잡음 비율 및 다양한 기록 능력 으로 인해 시스템 신경 과학 분야의 많은 연구자들이 선택하는 기술이 되었습니다. 행동 패러다임1,2,3,4,5,6,7,8. 기존의 전기 생리학적 방법과 는 달리, 광도측정은 유전자 부호가 코딩된 칼슘 지표(GECIs, GCaMP 계열)와 함께 가장 일반적으로 사용되는 광학접근법9. GECIs는 칼슘에 결합되어 있는지 여부에 따라 형광 능력을 변경합니다. 뉴런의 칼슘 의 내부 농도는 매우 엄격하게 조절되고 전압 게이트 칼슘 채널이 열리기 때문에 뉴런이 작용 전위를 발사할 때, 내부 칼슘 농도가 일시적으로 증가하여 일시적인 증가를 초래합니다. 형광에 GECI의 능력, 신경발사에대한 좋은 프록시가 될 수 있습니다 9 .
광섬유 광도 측정을 사용하면 여기 광이 얇고 다중 모드 광섬유를 뇌로 향하며 방출 신호가 동일한 섬유를 통해 다시 수집됩니다. 이러한 광섬유는 가볍고 구부릴 수 있기 때문에 동물이 크게 방해받지 않고 움직일 수 있으므로 이 기술은 다양한 행동 테스트 및 조건과 호환됩니다. 전체 내부 반사를 유지할 수 있는 반경을 초과하는 광섬유 패치 코드의 빠른 움직임이나 굽힘과 같은 일부 조건은 신호 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 소음의 신호를 모호하게 하기 위해 “isosbestic 지점”으로 알려진 GCaMP의 속성을 악용할 수 있습니다. 간단히 말해서, GCaMP를 사용하면 여기 빛의 파장이 왼쪽으로 이동함에 따라 칼슘 결합 상태에서의 방출이 감소하고 칼슘 언바운드 상태에서의 방출이 소폭 증가합니다. 이 두 방출의 상대강도가 동일한 지점을 isosbestic 점이라고 합니다. 이 시점에서 GCaMP가 흥분되면 방출은 내부 칼슘 농도의 변화에 의해 영향을받지 않으며 신호의 차이는 광섬유 패치 코드의 과감 또는 신경 조직의 움직임으로 인한 신호감 쇠약으로 인해 가장 빈번합니다. 이식된 섬유에 상대적입니다.
단일 단위 전기 생리학은 단일 셀 및 단일 스파이크 레벨 해상도로 인해 생체 내에서 자유롭게 움직이는 기록의 금 본위제입니다. 그러나, 기록되는 세포의 분자 동일을 찾아내기 어려울 수 있고, 사후 분석은 아주 힘들 수 있습니다. 섬유 광도측정은 단세포 분해능이 없지만, 연구자들은 전통적인 기술로는 해결할 수 없는 질문을 할 수 있습니다. 바이러스 성 전략을 형질전환 동물과 결합하여 GECIs의 발현은 축축한에서 직접 칼슘 신호를 모니터링하여 수행 할 수있는 인구 또는 투영 정의 신경 활동을 기록하기 위해 유전적으로 정의 된 신경 유형으로 지시 될 수 있습니다. 터미널10,11. 더욱이, 다중 광섬유 캐뉼라를 이식함으로써, 동일한 동물12,13에서여러 뇌 영역 및 경로로부터의 신경 활동을 동시에 모니터링할 수 있다.
이 원고에서는 단일 및 다중 섬유 광도 측정기, 칼슘 독립적 인 아티팩트를 수정하는 방법 및 모노 및 이중 색상 기록을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 질문할 수 있는 질문 유형과 증가하는 복잡성 수준에 대한 예제도 제공합니다(그림 1참조). 이 프로토콜에 자세히 설명된 다중 섬유 기록을 위한 광섬유 광도계 설정은 https://sites.google.com/view/multifp/hardware 있는 재료 목록을 사용하여 구축할 수있습니다(그림 2).
GCaMP6 또는 그 변이체에서 칼슘 독립적 및 칼슘 의존형 형광 방출을 위해 410 nm 및 470 nm 여기 파장 모두에 시스템을 장착하는 것이 필수적입니다. 사용자 정의 구축 설정또는 시스템을 실행할 수있는 소프트웨어가없는 경우, 무료 오픈 소스 프로그램 Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/)를 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 광섬유 광도측정은 MATLAB(예를 들어, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 또는 다른 프로그래밍 언어14를통해 실행될 수 있다. 시스템의 소프트웨어 및 하드웨어는 410 nm 및 470 nm LED와 카메라, 이미지 추출(그림 2)및 관심 영역 (ROI)의 평균 형광 강도를 모두 조작 할 수 있어야합니다. 이미지를 볼 수 있습니다. 출력은 패치 코드의 각 섬유에서 470 nm 및 410 nm LED로 기록된 평균 강도 값의 테이블이어야 합니다. 다중 섬유 실험을 수행할 때, 400 μm 번들 섬유는 마우스의 움직임을 제한할 수 있다. 이러한 경우 유연성을 제공하는 200 μm 패치 코드를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 마우스의 훈련 중에 더 작은 더미 케이블을 사용할 수도 있습니다.
광섬유 광도 측정을 획득하는 동안 관심 있는 이벤트에 대한 시간 포인트를 추출하는 것이 중요합니다. 시스템이 특정 이벤트에 대해 TTL을 통합하는 기본 제공 시스템을 쉽게 제공하지 않는 경우, 다른 전략은 실험 중에 특정 시간 및 이벤트에 맞게 기록된 개별 타임포인트에 타임스탬프를 할당하는 것입니다. 타임 스탬프는 컴퓨터 시계를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
섬유 광도계는 연구원이 자유롭게 움직이는 동물에 있는 정의된 신경 인구에서 벌크 칼슘 역학을 기록할 수 있는 접근접근접근입니다. 이 방법은 강제 수영 테스트2,공포 조절18,사회적 상호 작용1,4및 기타7과같은 “운동 무거운”작업을 포함하여 다양한 행동 테스트와 결합 될 수있습니다. <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC : RGPIN-2017-06131)에서 C.P. C. C. P.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 FRSQ 체르쉐르 부르시에입니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 사용된 바이러스 성 벡터의 생산을 위한 Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom)에게 감사합니다.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
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