Summary

Fotometría multifibra para registrar la actividad neuronal en animales en movimiento libre

Published: October 20, 2019
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Summary

Este protocolo detalla cómo implementar y realizar grabaciones de fotometría multifibra, cómo corregir artefactos independientes del calcio y consideraciones importantes para la toma de imágenes de fotometría de doble color.

Abstract

Registrar la actividad de un grupo de neuronas en un animal que se mueve libremente es una tarea difícil. Además, a medida que el cerebro se disecciona en subgrupos funcionales más pequeños y más pequeños, se vuelve primordial registrar a partir de proyecciones y/o subpoblaciones genéticamente definidas de las neuronas. La fotometría de fibra es un enfoque accesible y potente que puede superar estos desafíos. Mediante la combinación de metodologías ópticas y genéticas, la actividad neuronal se puede medir en estructuras cerebrales profundas mediante la expresión de indicadores de calcio codificados genéticamente, que traducen la actividad neuronal en una señal óptica que se puede medir fácilmente. El protocolo actual detalla los componentes de un sistema de fotometría multifibra, cómo acceder a estructuras cerebrales profundas para entregar y recoger luz, un método para tener en cuenta los artefactos de movimiento y cómo procesar y analizar señales fluorescentes. El protocolo detalla consideraciones experimentales al realizar imágenes de color simple y doble, ya sea de fibras ópticas de implante simple o múltiple.

Introduction

La capacidad de correlacionar las respuestas neuronales con aspectos específicos del comportamiento de un animal es fundamental para entender el papel que desempeña un grupo particular de neuronas en la dirección o respuesta a una acción o estímulo. Dada la complejidad del comportamiento animal, con la infinidad de estados internos y estímulos externos que pueden afectar incluso a las acciones más simples, el registro de una señal con resolución de un solo ensayo dota a los investigadores de las herramientas necesarias para superarlas Limitaciones.

La fotometría de fibra se ha convertido en la técnica de elección para muchos investigadores en el campo de la neurociencia de sistemas debido a su relativa simplicidad en comparación con otras técnicas de grabación in vivo, su alta relación señal-ruido, y la capacidad de grabar en una variedad de paradigmas conductuales1,2,3,4,5,6,7,8. A diferencia de los métodos electrofisiológicos tradicionales, la fotometría es el enfoque óptico más comúnmente utilizado junto con indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, la serie GCaMP)9. Las GECI cambian su capacidad de fluorescencia en función de si están o no vinculadas al calcio. Debido a que la concentración interna de calcio en las neuronas está muy estrictamente regulada y los canales de calcio cerrados por voltaje se abren cuando una neurona dispara un potencial de acción, aumentos transitorios en la concentración interna de calcio, que resultan en aumentos transitorios en el capacidad de un GECI a la fluorescencia, puede ser un buen proxy para el disparo neuronal9.

Con la fotometría de fibra, la luz de excitación se dirige hacia abajo una fibra óptica delgada y multimodo en el cerebro, y una señal de emisión se recoge de nuevo a través de la misma fibra. Debido a que estas fibras ópticas son ligeras y flexibles, un animal puede moverse en gran medida sin obstáculos, haciendo que esta técnica sea compatible con una amplia gama de pruebas y condiciones conductuales. Algunas condiciones, como los movimientos rápidos o la flexión del cable de conexión de fibra óptica más allá del radio en el que puede mantener la reflexión interna total, pueden introducir artefactos de señal. Para desambiguar la señal del ruido, podemos explotar una propiedad de GCaMP conocida como el “punto isosbestico”. Brevemente, con GCaMP, a medida que la longitud de onda de la luz de excitación se desplaza hacia la izquierda, su emisión en el estado ligado al calcio disminuye y la emisión en el estado de calcio no unido aumenta marginalmente. El punto en el que la intensidad relativa de estas dos emisiones es igual se denomina punto isosbestico. Cuando GCaMP se excita en este punto, su emisión no se ve afectada por los cambios en las concentraciones internas de calcio, y la varianza en la señal se debe más a menudo a la atenuación de la señal de sobredoblamiento del cordón de parche de fibra óptica o movimiento del tejido neural en relación con la fibra implantada.

La electrofisiología de una sola unidad sigue siendo el estándar de oro para las grabaciones in vivo que se mueven libremente debido a su resolución de nivel de una sola célula y de un solo pico. Sin embargo, puede ser difícil identificar la identidad molecular de las células que se registran, y el análisis post-hoc puede ser bastante laborioso. Si bien la fotometría de fibra no tiene resolución de una sola célula, sí permite a los investigadores hacer preguntas imposibles de abordar con técnicas tradicionales. Combinando estrategias virales con animales transgénicos, la expresión de GECI se puede dirigir a tipos neuronales definidos genéticamente para registrar la actividad neuronal definida por la población o la proyección, que se puede realizar mediante el seguimiento de la señal de calcio directamente en el axón terminales10,11. Además, mediante el implante de múltiples cánulas de fibra óptica, es posible monitorear simultáneamente la actividad neuronal de varias regiones cerebrales y vías en el mismo animal12,13.

En este manuscrito, describimos una técnica para fotometría de fibra única y multifibra, cómo corregir artefactos independientes del calcio y detallar cómo realizar grabaciones mono y doble color. También proporcionamos ejemplos de los tipos de preguntas que se pueden hacer y sus crecientes niveles de complejidad (véase la figura 1). La configuración de fotometría de fibra para grabaciones multifibra detalladas en este protocolo se puede construir utilizando una lista de materiales que se encuentran en https://sites.google.com/view/multifp/hardware(Figura 2).

Es esencial que el sistema esté equipado para longitudes de onda de excitación de 410 nm y 470 nm para la emisión de fluorescencia independiente del calcio y dependiente del calcio de GCaMP6 o sus variantes. Para configuraciones personalizadas o si no hay ningún software disponible para ejecutar el sistema, se puede utilizar el programa libre y de código abierto Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/). Alternativamente, la fotometría de fibra se puede ejecutar a través de MATLAB (por ejemplo, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 u otro lenguaje de programación14. El software y el hardware del sistema deben permitir la manipulación de los LED de 410 nm y 470 nm y de la cámara, la extracción de imágenes(Figura 2),y el cálculo de la intensidad fluorescente media en las regiones de interés (ROI) dibujadas alrededor de las fibras en las imágenes. La salida debe ser una tabla de valores de intensidad media registrados con los LED de 470 nm y 410 nm de cada fibra en el cable de conexión. Cuando se realizan experimentos multifibra, las fibras agrupadas de 400 m pueden limitar el movimiento de los ratones. En tales casos, se recomienda el uso de cables de parche de 200 m, que proporcionan más flexibilidad. También puede ser posible utilizar cables ficticios más pequeños durante el entrenamiento de ratones.

Es crucial poder extraer puntos de tiempo para eventos de interés durante la adquisición de fotometría de fibra. Si el sistema no proporciona fácilmente un sistema integrado para integrar TTLs para eventos específicos, una estrategia alternativa es asignar una marca de tiempo a los puntos de tiempo individuales registrados para alinearse con tiempos y eventos específicos durante el experimento. La marca de tiempo se puede realizar utilizando el reloj del ordenador.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, San Diego, y la Guía Canadiense para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Universidad Laval Animal Protection Comité. 1. Alineación de la trayectoria óptica entre la cámara CMOS (semiconductor de óxido metálico complementario) y el cable de conexión individual o ramificado Afloje todos los tornillos del…

Representative Results

Los correlatos neuronales de las respuestas conductuales pueden variar dependiendo de una variedad de factores. En este ejemplo, utilizamos fotometría de fibra in vivo para medir la actividad de los terminales de axón desde el área hipotalámica lateral (LHA) que terminan en la habenula lateral (LHb). Los ratones de tipo salvaje fueron inyectados con un virus asociado a adeno (AAV) que codificaba GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) en la LHA y se implantó una fibra óptica con la punta inmediatamente por encima del LHb<strong…

Discussion

La fotometría de fibra es un enfoque accesible que permite a los investigadores registrar la dinámica de calcio a granel de poblaciones neuronales definidas en animales que se mueven libremente. Este método se puede combinar con una amplia gama de pruebas de comportamiento, incluyendo tareas “pesadas de movimiento” tales como pruebas de natación forzada2, miedo-acondicionamiento18, interacciones sociales1,4, y o…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC: RGPIN-2017-06131) a C.P. C. P. es un FRSQ Chercheur-Boursier. También agradecemos al Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) la producción de los vectores virales utilizados en este estudio.

Materials

1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25×36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 – M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

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Cite This Article
Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

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