Multi fiber fotometri til registrering af neurale aktiviteter i frit bevægende dyr
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man implementerer og udfører multifiber fotometriske optagelser, hvordan man korrigerer for calcium-uafhængige artefakter, og vigtige overvejelser for dual-Color fotometri Imaging.
Abstract
Registrering af aktiviteten af en gruppe af neuroner i et frit bevægende dyr er en udfordrende virksomhed. Desuden, da hjernen er dissekeret i mindre og mindre funktionelle undergrupper, det bliver altafgørende at registrere fra fremskrivninger og/eller genetisk definerede subpopulationer af neuroner. Fiber fotometri er en tilgængelig og kraftfuld tilgang, der kan overvinde disse udfordringer. Ved at kombinere optiske og genetiske metoder kan neurale aktiviteter måles i dybe hjernestrukturer ved at udtrykke genetisk kodede calcium indikatorer, som omsætter neurale aktiviteter til et optisk signal, der let kan måles. Den nuværende protokol beskriver komponenterne i en multi-fiber fotometri system, hvordan man adgang dybe hjernestrukturer til at levere og indsamle lys, en metode til at konto for motion artefakter, og hvordan man behandler og analyserer fluorescerende signaler. Protokollen beskriver eksperimentelle overvejelser, når du udfører enkelt og dobbelt farve billeddannelse, fra enten enkelt eller flere implanterede optiske fibre.
Introduction
Evnen til at korrelere neurale reaktioner med specifikke aspekter af et dyrs adfærd er afgørende for at forstå den rolle, en bestemt gruppe af neuroner spiller i at lede eller reagere på en handling eller stimulus. I betragtning af kompleksiteten af dyrs adfærd, med myriader af interne stater og eksterne stimuli, der kan påvirke selv den enkleste af handlinger, optagelse af et signal med enkelt-Trial resolution udstyre forskerne med de nødvendige værktøjer til at overvinde disse Begrænsninger.
Fiber fotometri er blevet den foretrukne teknik for mange forskere inden for systemer Neurovidenskab på grund af sin relative enkelhed i forhold til andre in vivo optagelses teknikker, dens høje signal-støj-forhold, og evnen til at optage i en række forskellige adfærdsmæssige paradigmer1,2,3,4,5,6,7,8. I modsætning til traditionelle elektrofysiologiske metoder er fotometri den optiske tilgang, der oftest anvendes sammen med genetisk kodede calcium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs ændre deres evne til at fluorescerer baseret på, om de er bundet til calcium. Fordi den interne koncentration af calcium i neuroner er meget stramt reguleret og spændings-gated calcium kanaler åbne, når en neuron brande et aktionspotentiale, forbigående stigninger i den indre calciumkoncentration, hvilket resulterer i forbigå lige stigninger i evne til en GECI til fluorescens, kan være en god proxy for neuronal fyring9.
Med fiber fotometri, excitation lys er rettet ned en tynd, multi mode optisk fiber i hjernen, og et emissions signal er indsamlet tilbage op gennem den samme fiber. Fordi disse optiske fibre er lette og bøjelige, kan et dyr bevæge sig stort set uhindret, hvilket gør denne teknik kompatibel med en bred vifte af adfærdsmæssige tests og betingelser. Nogle betingelser, såsom hurtige bevægelser eller bøjning af fiber-optisk patch ledning ud over den radius, hvor det kan opretholde total interne refleksion, kan introducere signal artefakter. For at skelne signal fra støj, kan vi udnytte en ejendom af GCaMP kendt som “isosbestic point.” Kort, med GCaMP, som bølgelængden af excitation lys er flyttet til venstre, dens emission i den calcium-bundne tilstand falder og emissionen i den calcium-ubundne tilstand marginalt stiger. Det punkt, hvor den relative intensitet af disse to emissioner er lige, kaldes det isosbestiske punkt. Når GCaMP er spændt på dette tidspunkt, dets emission er upåvirket af ændringer i de interne calcium koncentrationer, og variansen i signalet er oftest på grund af dæmpning af signalet fra over bøjningen af fiber-optisk patch ledning eller bevægelse af neurale væv i forhold til den implanterede fiber.
Enkelt enhed Elektrofysiologi er stadig den gyldne standard for frit-at flytte in vivo optagelser på grund af sin enkelt-celle og single-Spike niveau opløsning. Det kan imidlertid være vanskeligt at identificere den molekylære identitet af de celler, der registreres, og post-hoc-analysen kan være ganske omstændelig. Mens fiber fotometri ikke har en enkelt celle opløsning, det gør det muligt for forskerne at stille spørgsmål umuligt at behandle med traditionelle teknikker. Ved at kombinere virale strategier med transgene dyr kan ekspression af GECIs rettes mod genetisk definerede neuronal typer til registrering af populations-eller projektions definerede neurale aktiviteter, som kan udføres ved at overvåge calcium signalet direkte ved Axon klemme10,11. Ved at implante flere fiberoptiske kanyle, er det desuden muligt samtidig at overvåge neurale aktiviteter fra flere hjerneområder og veje i samme dyr12,13.
I dette manuskript beskriver vi en teknik til enkelt-og multifiber fotometri, hvordan man korrigerer for calcium-uafhængige artefakter, og detaljer hvordan man udfører mono-og Dual-Color optagelser. Vi giver også eksempler på de typer af spørgsmål, det giver mulighed for at spørge og deres stigende kompleksitet (Se figur 1). Fiber fotometri opsætningen for multifiber optagelser, der er beskrevet i denne protokol, kan bygges ved hjælp af en liste over materialer fundet på https://sites.google.com/view/multifp/hardware (figur 2).
Det er vigtigt, at systemet er udstyret til både 410 nm og 470 nm excitation bølgelængder for calcium-uafhængig og calcium-afhængige fluorescens emission fra GCaMP6 eller dens varianter. For specialbyggede opsætninger, eller hvis der ikke er nogen tilgængelig software til at køre systemet, kan det gratis open source-program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) bruges. Alternativt kan fiber fotometri køres gennem MATLAB (f. eks. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller andet programmeringssprog14. Systemets software og hardware bør muliggøre manipulation af både 410 nm-og 470 nm-lysdioderne og kameraet, ekstraktion af billeder (figur 2) og beregning af den gennemsnitlige fluorescerende intensitet i de områder af interesse (Rois), der tegnes omkring fibrene på billederne. Udgangen skal være en tabel med gennemsnitlige intensitetsværdier optaget med 470 nm og 410 nm lysdioder fra hver fiber i patch ledningen. Når du udfører multi-fiber eksperimenter, kan 400 μm bundtede fibre begrænse flytning af mus. I sådanne tilfælde anbefaler vi at bruge 200 μm patch ledninger, som giver mere fleksibilitet. Det kan også være muligt at bruge mindre dummy kabler under træning af mus.
Det er afgørende at være i stand til at udtrække tidspunkter for begivenheder af interesse under fiber fotometri erhvervelse. Hvis systemet ikke umiddelbart giver et indbygget system til at integrere Ttl’er for bestemte hændelser, er en alternativ strategi at tildele et tidsstempel til individuelle tidspunkter, der er registreret for at tilpasse sig bestemte tider og hændelser under eksperimentet. Tidsstempling kan gøres ved hjælp af computerens ur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiber fotometri er en tilgængelig tilgang, der giver forskerne mulighed for at registrere bulk-calcium dynamik fra definerede neuronal populationer i frit bevægende dyr. Denne metode kan kombineres med en bred vifte af adfærdsmæssige tests, herunder “bevægelse tunge” opgaver såsom tvungen svømme tests2, frygt-condition18, sociale interaktioner1,4, og andre7, <sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et stipendium fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) til C.P. C. P. er en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi takker også Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) for produktionen af de virale vektorer, der anvendes i denne undersøgelse.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
