Photométrie multifibres pour enregistrer l'activité neuronale chez les animaux en mouvement libre
Summary
Ce protocole détaille comment mettre en œuvre et exécuter des enregistrements de photométrie multifibres, comment corriger les artefacts indépendants du calcium et des considérations importantes pour l’imagerie photométrie bicolore.
Abstract
Enregistrer l’activité d’un groupe de neurones chez un animal en mouvement libre est une entreprise difficile. En outre, comme le cerveau est disséqué en sous-groupes fonctionnels de plus en plus petits, il devient primordial d’enregistrer à partir de projections et/ ou de sous-populations génétiquement définies de neurones. La photométrie en fibre est une approche accessible et puissante qui peut surmonter ces défis. En combinant des méthodologies optiques et génétiques, l’activité neuronale peut être mesurée dans des structures cérébrales profondes en exprimant des indicateurs de calcium génétiquement codés, qui traduisent l’activité neuronale en un signal optique qui peut être facilement mesuré. Le protocole actuel détaille les composants d’un système de photométrie multifibres, comment accéder aux structures profondes du cerveau pour délivrer et recueillir la lumière, une méthode pour rendre compte des artefacts de mouvement, et comment traiter et analyser les signaux fluorescents. Le protocole détaille les considérations expérimentales lors de l’exécution de l’imagerie mono et double couleur, à partir de fibres optiques implantées simples ou multiples.
Introduction
La capacité de corréler les réponses neuronales avec des aspects spécifiques du comportement d’un animal est essentielle pour comprendre le rôle qu’un groupe particulier de neurones joue dans la direction ou la réponse à une action ou un stimulus. Compte tenu de la complexité du comportement animal, avec la myriade d’états internes et de stimuli externes qui peuvent affecter même les actions les plus simples, l’enregistrement d’un signal avec une résolution d’essai unique équipe les chercheurs avec les outils nécessaires pour surmonter ces Limitations.
La photométrie de fibre est devenue la technique de choix pour beaucoup de chercheurs dans le domaine des neurosciences de systèmes en raison de sa simplicité relative comparée à d’autres techniques d’enregistrement in vivo, de son rapport signal-bruit élevé, et de la capacité d’enregistrer dans une série de paradigmes comportementaux1,2,3,4,5,6,7,8. Contrairement aux méthodes électrophysiologiques traditionnelles, la photométrie est l’approche optique la plus couramment utilisée en conjonction avec des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIs, la série GCaMP)9. Les GECI modifient leur capacité à fluorer en fonction du fait qu’ils sont ou non liés au calcium. Parce que la concentration interne de calcium dans les neurones est très étroitement réglementée et les canaux de calcium à rayons de tension s’ouvrent lorsqu’un neurone déclenche un potentiel d’action, les augmentations transitoires de la concentration interne de calcium, qui se traduisent par des augmentations transitoires de la capacité d’un GECI à la fluorescence, peut être un bon proxy pour le tir neuronal9.
Avec la photométrie de fibre, la lumière d’excitation est dirigée vers le bas une fibre optique mince et multimode dans le cerveau, et un signal d’émission est rassemblé vers le haut par la même fibre. Parce que ces fibres optiques sont légères et pliables, un animal peut se déplacer en grande partie sans entrave, ce qui rend cette technique compatible avec un large éventail de tests et de conditions comportementales. Certaines conditions, telles que les mouvements rapides ou la flexion du cordon de patch de fibre optique au-delà du rayon auquel il peut maintenir la réflexion interne totale, peuvent introduire des artefacts de signal. Pour désambiguer le signal du bruit, nous pouvons exploiter une propriété de GCaMP connue sous le nom de « point isosbestique ». En bref, avec GCaMP, comme la longueur d’onde de la lumière d’excitation est décalée vers la gauche, son émission dans l’état de calcium-lié diminue et l’émission dans l’état de calcium-unbound augmente légèrement. Le point auquel l’intensité relative de ces deux émissions est égale est appelé le point isosbestic. Lorsque GCaMP est excité à ce stade, son émission n’est pas affectée par les changements dans les concentrations internes de calcium, et la variance dans le signal est le plus souvent due à l’atténuation du signal de la surflexion du cordon de patch de fibre optique ou le mouvement du tissu neural par rapport à la fibre implantée.
L’électrophysiologie d’une seule unité demeure l’étalon-or pour les enregistrements in vivo en mouvement libre en raison de sa résolution de niveau à cellule unique et à un seul pic. Cependant, il peut être difficile d’identifier l’identité moléculaire des cellules enregistrées, et l’analyse post-hoc peut être assez laborieuse. Bien que la photométrie en fibre n’ait pas de résolution unicellulaire, elle permet aux chercheurs de poser des questions impossibles à aborder avec les techniques traditionnelles. Combinant des stratégies virales avec des animaux transgéniques, l’expression des IGE peut être dirigée vers des types neuronaux génétiquement définis pour enregistrer l’activité neuronale définie par la population ou la projection, qui peut être effectuée en surveillant le signal calcique directement à l’axone terminaux10,11. En outre, en implantant de multiples canules à fibres optiques, il est possible de surveiller simultanément l’activité neuronale de plusieurs régions et voies du cerveau chez le même animal12,13.
Dans ce manuscrit, nous décrivons une technique pour la photométrie simple et multi-fibre, comment corriger pour les artefacts calcium-indépendants, et détailler comment exécuter des enregistrements mono- et dual-color. Nous fournissons également des exemples des types de questions qu’il permet de poser et de leur niveau croissant de complexité (voir la figure 1). La configuration de la photométrie en fibre pour les enregistrements multifibres détaillés dans ce protocole peut être construite à l’aide d’une liste de matériaux trouvés à https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figure 2).
Il est essentiel que le système soit équipé pour les longueurs d’onde d’excitation de 410 nm et 470 nm pour les émissions de fluorescence dépendantes du calcium et du calcium de GCaMP6 ou de ses variantes. Pour les configurations personnalisées ou s’il n’y a pas de logiciel disponible pour exécuter le système, le programme libre et open source Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) peut être utilisé. Alternativement, la photométrie en fibre peut être exécuté par MATLAB (par exemple, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 ou tout autre langage de programmation14. Le logiciel et le matériel du système devraient permettre la manipulation des LED de 410 nm et 470 nm et de la caméra, l’extraction d’images (figure 2), et le calcul de l’intensité fluorescente moyenne dans les régions d’intérêt (ROI) dessinées autour des fibres sur les images. La sortie devrait être un tableau des valeurs d’intensité moyennes enregistrées avec les LED de 470 nm et 410 nm de chaque fibre dans le cordon de correction. Lors de l’exécution d’expériences multifibres, les fibres groupées de 400 m peuvent limiter le mouvement des souris. Dans de tels cas, nous vous recommandons d’utiliser des cordons patch de 200 m, qui offrent plus de flexibilité. Il peut également être possible d’utiliser de plus petits câbles factices pendant la formation des souris.
Il est crucial d’être en mesure d’extraire des points de temps pour les événements d’intérêt lors de l’acquisition de la photométrie fibre. Si le système ne fournit pas facilement un système intégré pour intégrer les TTL pour des événements spécifiques, une autre stratégie consiste à attribuer un horodatage aux points de temps individuels enregistrés pour s’aligner sur des moments et des événements spécifiques au cours de l’expérience. L’estampage peut être fait à l’aide de l’horloge de l’ordinateur.
Protocol
Representative Results
Discussion
La photométrie par fibre est une approche accessible qui permet aux chercheurs d’enregistrer la dynamique du calcium en vrac à partir de populations neuronales définies chez les animaux en mouvement libre. Cette méthode peut être combinée avec un large éventail de tests comportementaux, y compris “mouvement lourd” tâches telles que les tests de natation forcée2, la peur conditionnement18, interactions sociales1,4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG : RGPIN-2017-06131) à C.P. C. P. est un chercheur-boursier frSQ. Nous remercions également la Plateforme d’Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) pour la production des vecteurs viraux utilisés dans cette étude.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
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