मल्टी-फाइबर फोटोमेट्री फ्रीली-मोविंग जानवरों में तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल विवरण कैसे लागू करने के लिए और बहु फाइबर photometry रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, कैसे कैल्शियम स्वतंत्र कलाकृतियों के लिए सही करने के लिए, और दोहरी रंग photometry इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण विचार.
Abstract
एक स्वतंत्र रूप से चलती जानवर में न्यूरॉन्स के एक समूह की गतिविधि रिकॉर्डिंग एक चुनौतीपूर्ण उपक्रम है. इसके अलावा, के रूप में मस्तिष्क छोटे और छोटे कार्यात्मक उपसमूहों में विभाजित है, यह अनुमानों से रिकॉर्ड करने के लिए सर्वोपरि हो जाता है और / फाइबर फोटोमेट्री एक सुलभ और शक्तिशाली दृष्टिकोण है जो इन चुनौतियों को दूर कर सकता है। ऑप्टिकल और आनुवंशिक तरीकों के संयोजन से, तंत्रिका गतिविधि आनुवंशिक रूप से encoded कैल्शियम संकेतक है, जो एक ऑप्टिकल संकेत है कि आसानी से मापा जा सकता है में तंत्रिका गतिविधि अनुवाद व्यक्त करके गहरे मस्तिष्क संरचनाओं में मापा जा सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल एक बहु फाइबर photometry प्रणाली के घटकों का विवरण, कैसे गहरी मस्तिष्क संरचनाओं का उपयोग करने के लिए उद्धार और प्रकाश इकट्ठा, गति कलाकृतियों के लिए खाते में एक विधि, और कैसे प्रक्रिया और फ्लोरोसेंट संकेतों का विश्लेषण करने के लिए. प्रोटोकॉल विवरण प्रयोगात्मक विचार जब एकल और दोहरी रंग इमेजिंग प्रदर्शन, या तो एक या एकाधिक प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर से.
Introduction
एक जानवर के व्यवहार के विशिष्ट पहलुओं के साथ तंत्रिका प्रतिक्रियाओं सहसंबंधित करने की क्षमता भूमिका न्यूरॉन्स के एक विशेष समूह को निर्देशित करने या एक कार्रवाई या उत्तेजना के जवाब में खेलता है समझने के लिए महत्वपूर्ण है. पशु व्यवहार की जटिलता को देखते हुए, आंतरिक राज्यों और बाहरी उत्तेजनाओं के असंख्य है कि कार्यों का भी सरलतम को प्रभावित कर सकते हैं के साथ, एकल परीक्षण संकल्प के साथ एक संकेत रिकॉर्डिंग इन पर काबू पाने के लिए आवश्यक उपकरणों के साथ शोधकर्ताओं से लैस सीमाओं.
फाइबर photometry क्योंकि विवो रिकॉर्डिंग तकनीक में अन्य की तुलना में अपनी रिश्तेदार सादगी के सिस्टम तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं के लिए पसंद की तकनीक बन गया है, अपने उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात, और की एक किस्म में रिकॉर्ड करने की क्षमता व्यवहार प्रतिमान1,2,3,4,5,6,7,8. पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल तरीकों के विपरीत, photometry ऑप्टिकल दृष्टिकोण सबसे अधिक आनुवंशिक रूप से encoded कैल्शियम संकेतक (GECIs, GCaMP श्रृंखला)9के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है. जीईसी के आधार पर फ्लोरेसिस की अपनी क्षमता में परिवर्तन होता है कि वे कैल्शियम से बंधे हैं या नहीं। क्योंकि न्यूरॉन्स में कैल्शियम की आंतरिक एकाग्रता बहुत कसकर विनियमित है और वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल खुला जब एक न्यूरॉन एक कार्रवाई की क्षमता आग, क्षणिक आंतरिक कैल्शियम एकाग्रता में वृद्धि, जो क्षणिक में वृद्धि में परिणाम फ्लोरोसेंट के लिए एक जीसीआई की क्षमता, न्यूरॉन फायरिंग9के लिए एक अच्छा प्रॉक्सी हो सकता है।
फाइबर photometry के साथ, उत्तेजना प्रकाश मस्तिष्क में एक पतली, multimode ऑप्टिक फाइबर नीचे निर्देशित है, और एक उत्सर्जन संकेत वापस एक ही फाइबर के माध्यम से एकत्र की है. क्योंकि इन ऑप्टिक फाइबर हल्के और bendable हैं, एक जानवर काफी हद तक unhindered स्थानांतरित कर सकते हैं, इस तकनीक व्यवहार परीक्षण और शर्तों की एक विस्तृत सरणी के साथ संगत बना रही है. कुछ शर्तों, जैसे तेजी से आंदोलनों या त्रिज्या जिस पर यह कुल आंतरिक प्रतिबिंब बनाए रख सकते हैं परे फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड के झुकने, संकेत कलाकृतियों परिचय कर सकते हैं. शोर से संकेत disambiguate करने के लिए, हम GCaMP के एक गुण का दोहन कर सकते हैं के रूप में जाना जाता है “isosbestic बिंदु.” संक्षेप में, GCaMP के साथ, के रूप में उत्तेजना प्रकाश की तरंगदैर्ध्य बाईं ओर स्थानांतरित कर दिया है, कैल्शियम बाध्य राज्य में अपने उत्सर्जन कम हो जाती है और कैल्शियम असीमित राज्य में उत्सर्जन मामूली बढ़ जाती है. वह बिंदु जिस पर इन दो उत्सर्जनों की सापेक्ष तीव्रता बराबर है, उसे समस्थाक बिंदु कहते हैं। जब GCaMP इस बिंदु पर उत्साहित है, अपने उत्सर्जन आंतरिक कैल्शियम सांद्रता में परिवर्तन से अप्रभावित है, और संकेत में विचरण सबसे अक्सर फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड या तंत्रिका ऊतक के आंदोलन के overbending से संकेत के क्षीणन के कारण है प्रत्यारोपित फाइबर के सापेक्ष.
एकल इकाई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अभी भी अपने एकल सेल और एकल स्पाइक स्तर संकल्प के कारण विवो रिकॉर्डिंग में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ने के लिए सोने के मानक है। हालांकि, यह दर्ज की जा रही कोशिकाओं की आणविक पहचान इंगित करने के लिए मुश्किल हो सकता है, और पोस्ट-हॉक विश्लेषण काफी कठिन हो सकता है। जबकि फाइबर photometry एकल सेल संकल्प नहीं है, यह शोधकर्ताओं पारंपरिक तकनीकों के साथ पता करने के लिए असंभव सवाल पूछने के लिए अनुमति देता है. ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ वायरल रणनीतियों के संयोजन, GECIs की अभिव्यक्ति जनसंख्या दर्ज करने के लिए आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन प्रकार के लिए निर्देशित किया जा सकता है- या प्रक्षेपण परिभाषित तंत्रिका गतिविधि, जो एक्सॉन में सीधे कैल्शियम संकेत की निगरानी द्वारा किया जा सकता है टर्मिनल10,11. इसके अलावा, कई फाइबर ऑप्टिक cannulas प्रत्यारोपण द्वारा, यह एक ही जानवर12,13में कई मस्तिष्क क्षेत्रों और रास्ते से तंत्रिका गतिविधि पर नजर रखने के लिए संभव है.
इस पांडुलिपि में, हम एकल और बहु फाइबर photometry के लिए एक तकनीक का वर्णन, कैसे कैल्शियम स्वतंत्र कलाकृतियों के लिए सही करने के लिए, और विस्तार कैसे मोनो प्रदर्शन करने के लिए- और दोहरे रंग रिकॉर्डिंग. हम उन प्रश्नों के प्रकारों के उदाहरण भी प्रदान करते हैं जो यह किसी को पूछने में सक्षम बनाता है और उनके जटिलता के बढ़ते स्तर (चित्र 1देखें)। इस प्रोटोकॉल में विस्तृत बहु फाइबर रिकॉर्डिंग के लिए फाइबर photometry सेटअप https://sites.google.com/view/multifp/hardware में पाया सामग्री की एक सूची का उपयोग कर बनाया जा सकता है (चित्र 2).
यह आवश्यक है कि प्रणाली दोनों के लिए सुसज्जित किया जाना 410 एनएम और 470 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य कैल्शियम स्वतंत्र और कैल्शियम पर निर्भर fluorscence उत्सर्जन के लिए GCaMP6 या इसके वेरिएंट से. कस्टम निर्मित setups के लिए या यदि सिस्टम को चलाने के लिए कोई उपलब्ध सॉफ़्टवेयर नहीं है, तो मुक्त, खुला स्रोत प्रोग्राम Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) का उपयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, फाइबर photometry MATLAB के माध्यम से चलाया जा सकता है (उदा. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 या अन्य प्रोग्रामिंग भाषा14. सॉफ्टवेयर और प्रणाली के हार्डवेयर दोनों 410 एनएम और 470 एनएम एल ई डी और कैमरा, छवियों की निकासी के हेरफेर की अनुमति चाहिए (चित्र 2), और ब्याज के क्षेत्रों में मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता की गणना (आरओआई) पर फाइबर के आसपास तैयार छवियों. उत्पादन मतलब तीव्रता मूल्यों की एक मेज होना चाहिए 470 एनएम और पैच कॉर्ड में प्रत्येक फाइबर से 410 एनएम एल ई डी के साथ दर्ज की गई. बहु फाइबर प्रयोगों प्रदर्शन करते समय, 400 डिग्री मीटर बंडल फाइबर चूहों के आंदोलन को सीमित कर सकते हैं. ऐसे मामलों में, हम 200 डिग्री पैच डोरियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं। यह भी चूहों के प्रशिक्षण के दौरान छोटे डमी केबल का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता है.
यह फाइबर photometry अधिग्रहण के दौरान ब्याज की घटनाओं के लिए समय अंक निकालने के लिए सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि सिस्टम विशिष्ट ईवेंट के लिए टीटीएल को एकीकृत करने के लिए आसानी से अंतर्निहित सिस्टम प्रदान नहीं करता है, तो प्रयोग के दौरान विशिष्ट समय और ईवेंट के साथ संरेखित करने के लिए रिकॉर्ड किए गए अलग-अलग समय बिंदुओं को एक समय मोहर असाइन करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति है. समय मुद्रांकन कंप्यूटर घड़ी का उपयोग किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
फाइबर फोटोमेट्री एक सुलभ दृष्टिकोण है जो शोधकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में परिभाषित न्यूरोनल आबादी से थोक-कैल्शियम गतिशीलता रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है। इस विधि व्यवहार परीक्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC: RGPIN-2017-06131) से सी.पी.सी. हम भी इस अध्ययन में इस्तेमाल वायरल वैक्टर के उत्पादन के लिए Plateforme d’Outils मोलिकलेयर्स (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) धन्यवाद.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
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