Multifiberfotometri för att registrera neurala aktiviteter i fritt rörliga djur
Summary
Detta protokoll specificerar hur man implementerar och utför multifiberfotometri inspelningar, hur man rättar för kalcium-oberoende artefakter, och viktiga överväganden för Dual-Color fotometri Imaging.
Abstract
Registrering av aktiviteten hos en grupp av nervceller i ett fritt rörligt djur är ett utmanande företag. Dessutom, som hjärnan dissekeras i mindre och mindre funktionella undergrupper, det blir avgörande att spela in från prognoser och/eller genetiskt definierade subpopulationer av nervceller. Fiberfotometri är en tillgänglig och kraftfull metod som kan övervinna dessa utmaningar. Genom att kombinera optiska och genetiska metoder, neurala aktivitet kan mätas i djupa hjärnstrukturer genom att uttrycka genetiskt kodade kalcium indikatorer, som översätter neurala aktivitet till en optisk signal som lätt kan mätas. Det aktuella protokollet specificerar komponenterna i ett multifiberfotometri-system, hur man tillgång till djupa hjärnstrukturer för att leverera och samla in ljus, en metod för att redogöra för rörelse artefakter, och hur man bearbetar och analyserar fluorescerande signaler. Protokollet Detaljer experimentella överväganden när du utför enkel och dubbel färg avbildning, från antingen enstaka eller flera implanterade optiska fibrer.
Introduction
Förmågan att korrelera neurala svar med specifika aspekter av ett djurs beteende är avgörande för att förstå den roll en viss grupp av nervceller spelar i styra eller reagera på en åtgärd eller stimulans. Med tanke på komplexiteten i djurens beteende, med den myriad av inre stater och yttre stimuli som kan påverka även de enklaste av åtgärder, spela in en signal med en enda rättegång utrustar forskare med de nödvändiga verktygen för att övervinna dessa Begränsningar.
Fiber fotometri har blivit den teknik som val för många forskare inom området för system neurovetenskap på grund av dess relativa enkelhet jämfört med andra in vivo inspelningsteknik, dess höga signal-brus-förhållande, och förmågan att spela in i en mängd olika beteendemässiga paradigm1,2,3,4,5,6,7,8. Till skillnad från traditionella elektrofysiologiska metoder är fotometri den optiska metoden som oftast används tillsammans med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs ändra sin förmåga att fluorescera baserat på huruvida de är bundna till kalcium. Eftersom den interna koncentrationen av kalcium i nervceller är mycket hårt reglerad och spännings-gated kalciumkanaler öppna när en neuron bränder en åtgärd potential, övergående ökningar av intern kalciumkoncentration, vilket resulterar i övergående ökningar i förmåga att en GECI till fluorescens, kan vara en bra proxy för neuronala bränning9.
Med fiberfotometri, excitation ljus riktas ner en tunn, multimode optisk fiber i hjärnan, och en emissions signal samlas tillbaka upp genom samma fiber. Eftersom dessa optiska fibrer är lätta och böjbara, ett djur kan röra sig obehindrat, vilket gör denna teknik kompatibel med ett brett spektrum av beteendemässiga tester och villkor. Vissa villkor, såsom snabba rörelser eller böjning av fiberoptiska patch sladden bortom den radie där den kan upprätthålla total inre reflektion, kan införa signal artefakter. För att skilja signal från buller, kan vi utnyttja en egendom GCaMP kallas “isosbestic Point.” Kort med gcamp, som våglängden av magnetiseringen ljust skiftas till lämnat, dess utsläpp i Calcium-begränsar statliga minskningar och utsläppet i Calcium-obunden påstå marginellt förhöjningar. Den punkt där den relativa intensiteten av dessa två utsläpp är lika kallas den isosbestic punkt. När GCaMP är upphetsad på denna punkt, dess utsläpp påverkas inte av förändringar i interna kalciumkoncentrationer, och variansen i signalen är oftast på grund av dämpning av signalen från överböjning av fiberoptiska patch sladden eller förflyttning av neurala vävnad i förhållande till den implanterade fibern.
En enhet elektrofysiologi är fortfarande den gyllene standarden för fritt rörliga in vivo inspelningar på grund av dess Single-cell och Single-Spike nivå upplösning. Det kan dock vara svårt att precisera den molekylära identiteten hos de celler som registreras, och post-hoc-analysen kan vara ganska mödosam. Medan fiberfotometri inte har Single-cell upplösning, tillåter det forskare att ställa frågor omöjliga att ta itu med traditionella tekniker. Kombinera viral strategier med transgena djur, uttrycket av GECIs kan riktas till genetiskt definierade neuronala typer att registrera population-eller projektion definierade neurala aktivitet, som kan utföras genom att övervaka kalcium signalen direkt på Axon terminalerna10,11. Dessutom, genom att implantera flera fiberoptiska kanyler, är det möjligt att samtidigt övervaka neurala aktivitet från flera regioner i hjärnan och vägar i samma djur12,13.
I detta manuskript beskriver vi en teknik för enkel-och multifiberfotometri, hur man rättar till kalcium oberoende artefakter, och detalj hur man utför mono-och Dual-Color inspelningar. Vi ger också exempel på de typer av frågor som det gör det möjligt att fråga och deras ökande komplexitetsnivåer (se figur 1). Den fiber fotometri setup för multi-fiber inspelningar som beskrivs i detta protokoll kan byggas med hjälp av en lista över material som finns på https://sites.Google.com/View/multifp/Hardware (figur 2).
Det är viktigt att systemet utrustas för både 410 nm och 470 nm excitation våglängder för kalcium oberoende och kalciumberoende fluorescens emission från GCaMP6 eller dess varianter. För skräddarsydda inställningar eller om det inte finns någon tillgänglig programvara för att köra systemet, kan den fria, öppen källkod program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) användas. Alternativt kan fiberfotometri köras genom MATLAB (t. ex. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller annat programmeringsspråk14. Programvara och hårdvara i systemet bör möjliggöra manipulation av både 410 nm och 470 nm lysdioder och kameran, extraktion av bilder (figur 2), och beräkning av medelvärdet fluorescerande intensitet i de regioner av intresse (Rois) dras runt fibrerna på bilderna. Utdata bör vara en tabell över medelintensitetsvärden som registrerats med lysdioderna 470 nm och 410 nm från varje fiber i patch-sladden. När du utför multi-fiber experiment, 400 μm kombinerade fibrer kan begränsa rörligheten för möss. I sådana fall rekommenderar vi att du använder 200 μm patch sladdar, som ger mer flexibilitet. Det kan också vara möjligt att använda mindre dummy kablar under träning av möss.
Det är viktigt att kunna extrahera tid punkter för händelser av intresse under fiber fotometri förvärv. Om systemet inte ger ett inbyggt system för att integrera TTLs för specifika händelser, är en alternativ strategi att tilldela en tidsstämpel till enskilda tidspunkter registreras för att justera med specifika tider och händelser under experimentet. Tidsstämpling kan göras med datorklockan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiberfotometri är en tillgänglig metod som gör det möjligt för forskare att spela in bulk-kalciumdynamik från definierade neuronala populationer i fritt rörliga djur. Denna metod kan kombineras med ett brett spektrum av beteendemässiga tester, inklusive “rörelse tunga” uppgifter såsom påtvingade simma tester2, Fear-Conditioning18, sociala interaktioner1,4, och andra7, <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC: RGPIN-2017-06131) till C.P. är en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi tackar också Plateforme D’ outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) för produktion av de virala vektorer som används i denna studie.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
