Summary
我们为从成年小鼠大脑半球的不同解剖区域分离微胶质提供方案，然后为全长转录体进行深度单细胞RNA测序的半自动库制备。该方法将有助于阐明微胶质在健康和疾病中的功能异质性。
Abstract
作为中枢神经系统中的常住巨噬细胞，微胶质能积极控制大脑发育和平衡，其功能障碍可能导致人类疾病。在发现静温微胶质的分子特征以及其基因表达的变化以响应环境刺激方面取得了相当大的进展。随着单细胞基因组方法的出现和成熟，人们越来越认识到，异质微胶质可能是它们在不同发育和病理条件下所发挥的不同作用的基础。通过有效分离微胶质与特定感兴趣区域，然后对单个细胞进行敏感分析，可以进一步剖析这种异质性。在这里，我们提供了一个详细的协议，从单个成年小鼠大脑半球的不同大脑区域快速分离微胶质。我们还演示了如何使用这些排序的微胶用于基于板的深层单细胞RNA测序。我们讨论了此方法对其他场景的适应性，并为改进系统以适应大规模研究提供了指南。
Introduction
微胶质，占所有神经细胞的5%-10%，是分散在中枢神经系统（CNS）1的常驻巨噬细胞。在血脑屏障的背后，健康成人大脑中典型的微胶质包含许多精细过程，这些过程会迅速延伸和缩回，与脑血管瘤中的神经元和其他胶质细胞相互作用。微胶质也可以采用与在特定发育阶段或损伤和疾病1、2、3、4中的免疫挑战相关的与增加的咽喉功能相关的阿米巴细胞形态。最近令人振奋的发现清楚地表明，微胶质绝不是大脑衍生或病理信号的被动旁观者，但在控制大脑发育和平衡方面起着关键作用，例如，通过支持神经元生存、修剪未成熟的突触、促进寡核苷酸系细胞分化以及血管生成1。随着微胶质的更多功能被阐明，兴奋进一步由人类遗传学研究，这表明，许多神经退行性疾病风险基因，如TREM2，主要或完全表达微胶质5，6，7。鉴于它们在发育中的重要性和合理的疾病驱动作用，我们最近为理解微胶质基因调控和功能而付出巨大努力，以期找到神经退行性疾病1、8的新治疗靶点。
RNA测序（RNA-seq）允许对细胞类型特异性基因表达进行无偏的表征，这反过来又指导科学家研究致密细胞网络中的基因功能7。RNA-seq主要在大体积样品上进行，导致发现一种静温微胶质基因特征，使其与其他神经和免疫细胞9区分开来。然而，这种方法可以忽视微胶质之间的分子和功能差异，特别是那些暂时存在于发育中，或与衰老和疾病相关的差异。事实上，单细胞RNA-seq（scRNA-seq）提供了敏感性和分辨率，通过揭示以前未被认识的微胶质异质性，在各种上下文中2，3，10，彻底改变了该领域。此外，由于在CNS循环界面中存在其他类似的免疫细胞，scRNA-seq提供了信息，有助于设计新的工具，以分离和功能解剖这些相关细胞，而事先知之甚少2，11。
已经发明了一系列不同的scRNA-seq平台，每个平台都适合某些应用12。通常，基于滴滴的方法（如 10x 基因组学）的吞吐量较高，每次运行中测序的 （数千个）细胞，并且对于可能包含需要广泛分类的混合细胞群的输入的选择性较低。基于板的方法提供更高的灵敏度和读取深度13，14，通常针对特定人群从细胞排序，以揭示细微的差异或罕见的成绩单。鉴于在所有CNS细胞类型中微胶质细胞，特别是发育或疾病相关亚群的较小比例，通常可取地将微胶质从特定感兴趣的区域分离，并获取深度和全长转录组信息，以了解其异质性。
在这里，我们详细介绍了如何从从单个半球解剖的不同小鼠大脑区域分离微胶质，这些区域在半自动基于板的库制备程序后用于单细胞（或散装）RNA-seq。另一半球则可用于组织学验证。这种分离方案从先前公布的方法9中简化，旨在最大化少量起始材料的产量，同时维持内源性微胶质基因表达谱。我们使用荧光活性细胞分拣（FACS）将微胶质（或其他相关的相关免疫细胞）浓缩到96孔板中，并将试剂体积小型化，用于库制备，以提高产量。我们重点介绍这个敏感的scRNA-seq平台，尽管可以应用其他基于板的策略。这种方法可以很容易地适应，以分离微胶质从其他解剖组织，如损伤或疾病病灶，和小鼠的年龄可以改变几乎任何产后阶段。单细胞转录组学研究对区域微胶质的有效分离将有助于更好地了解其在健康和疾病中的功能。
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Protocol
涉及啮齿动物的所有程序都符合斯坦福大学的指导方针，该准则符合国家和州法律和政策。所有动物程序都通过了斯坦福大学实验室动物护理行政小组的批准。
注：所有溶液和缓冲组合物均在材料表中提供。
1. 细胞隔离日的准备工作
- 准备以下试剂并将其冷却在冰上：中等A（50 mL）、磁活细胞分拣（MCS）缓冲液（30 mL）、FACS缓冲液（25 mL）、磷酸盐缓冲盐水（PBS;30 mL）、DNase（320 μL）和RNase抑制剂（30 μL）。
注：这里提供的体积足以从单个小鼠大脑半球的4个大脑区域（如皮层、小脑、海马和纹状体）中分离微胶质。如果使用更多组织，则向上扩展。 - 将4个干净的2 mL光合质器放在冰上，并在每个脱粒均质器中加入2 mL的A介质，其中80μL的DNase（12，500单位/mL）和5μL的RNase抑制剂。在 15 mL 管中冷却活塞。
- 标记四个6厘米培养皿与大脑区域组织收集，并添加200μL的冷介质A到每盘冰上。将约 5 mL 的介质 A 添加到 6 厘米培养皿中进行解剖。
注：使用前，确保所有试剂无菌且适合RNA应用。台面和解剖工具需要清洁，并喷洒RNase去污溶液（材料表）。
2. 脑区解剖
注：此步骤应需要约 30 分钟。
- 将400~500 μL的氯胺酮/木氨酸（24毫克/mL氯胺酮和2.4毫克/mL木兰西他辛）注射到幼年鼠的围护中（>1个月大）。
注：此处使用雄性鼠标进行插图，但任一性别都适合。 - 等待 5 分钟，捏一个后爪，以确保没有回缩。
- 立即使用 26 G x 3/8 针使用 20~30 mL 的冷型 PBS 进行转盘灌注，直到缓冲液用完，没有可见血液。
- 用一把手术剪刀把老鼠斩首。用小剪刀切开皮肤，露出头骨下面，然后切开下垂缝合线、羔羊皮缝合线和冠状缝合线。使用钳子拉出骨骼和间断骨的两侧，而不会损坏组织，并小心地将大脑移入具有中等 A 的解剖培养皿中。
- 使用预冷却刀片将大脑穿过中线切成两个半球。
注：这里描述的四个大脑区域从一个单一半产生足够的微胶质为单细胞或散装RNA-seq应用。另一半球可用于免疫性化学或RNA原位验证。 - 用#55钳将小脑从皮质叶和脑干中分离出来，并将组织转移到集合培养皿中。
- 使用#55钳子仔细解剖出海马和纹状体从皮层，并转移每个组织到一个集合培养皿。
3. 机械组织分离
注：除非在染色步骤中，否则会一直保持细胞和试剂冷却。此步骤应需要约 30 分钟。
- 用剃刀刀片将每个脑组织切成 <1 mm3细片。
- 使用 1 mL 移液器（切断吸头）将组织件转移到预冷却的 Dounce 均质器中，每个液位包含 2 mL 的 A 培养基，带有 DNase 和 RNase 抑制剂。
- 通过缓慢地将活塞扭出"点"均质器进行 6–10 次完全冲程，直到不存在可见块，使组织变均匀。
注：点胶会杀死神经元和大多数其他胶质细胞，但使微胶质细胞保持相当完整。不足和过度的解决都会导致细胞产量低。 - 通过70μm滤网将分离组织转移到50mL管中。
- 用总共 6 mL 的冷介质 A 冲洗每个大通式和活塞，并通过同一滤网将冲洗溶液过滤到相应的管中。
- 将单细胞悬浮液（每个约8 mL）转移到15 mL锥形管中，在4°C下以400 x g离心5分钟，制动= 5。
4. 骨髓去除
注：此步骤需要约 60 分钟。
- 在磁分离器（材料表）中准备 1 个大损耗 （LD） 列（用于皮层）和 3 个大选择 （LS） 列（对于其他 3 个区域）。用 3 mL 的 MCS 缓冲液冲洗每列。
- 离心完成后，移液器流出并丢弃上清液，而不会干扰颗粒。对于皮层和小脑组织，用1.8μL的RN酶抑制剂在850μL的MCS缓冲液中重新悬浮细胞。对于海马和纹状体组织，用0.9μL的RNase抑制剂在400μL的MCS缓冲液中重新悬浮细胞。
注：列（LD 与 LS）和用于重新悬浮的体积根据组织中存在的骨髓量进行了优化。如果其他大脑区域被测定，这些条件可能需要根据组织的大小和骨髓可能存在多少进行调整。在步骤4.9中可以估计骨髓去除的有效性。 - 将100μL的骨髓去除珠分别加入皮层和小脑的细胞中，并加入50μL的骨髓去除珠子，每个珠子从海马和纹状体进入细胞。
- 轻轻地将细胞与珠子混合，在冰上孵育管子10分钟。
- 使用MCS缓冲液将带皮质细胞的管的体积达到2 mL，并将所有其他体积增加到1 mL（即，为皮质细胞添加1 mL;海马和纹状细胞增加500 μL;无需向小脑细胞添加缓冲液）。
- 一旦柱没有浸液缓冲液，将每列下方放置一个 15 mL 的管。将皮质细胞 （2 mL） 加载到 LD 列上，将所有其他（每个 1 mL）加载到 LS 列上。立即使用 1 mL 的 MCS 缓冲液，每个缓冲液清洗原始管，并将溶液加载到相应的柱上。
- 用 1 mL 的 MCS 缓冲液清洗 LD 列一次，每次洗涤时用 1 mL 的 MCS 缓冲液洗涤每个 LS 列两次。在洗涤过程中继续收集流过溶液。
- 通过 35 μm 滤网盖将细胞过滤到圆形底部 FACS 管中。
注：每个管应收集约4 mL的单细胞悬浮液耗尽的骨髓。 - 可选择服用10μL的细胞悬浮液，并将其与10μL的0.4%锥蓝色溶液混合。在10倍的明亮场显微镜下检查细胞，以估计产量、存活率和残留骨髓水平。
注：成功的制备应产生超过90%的活细胞（圆形，不包括蓝色染料），很少或没有骨髓碎片。 - 在 4°C 下，在 400 x g的 FACS 管中，在 4°C 下 5 分钟，制动 = 5。慢慢倒出上清液，在纸巾上涂抹管的边缘。用300μL的FACS缓冲液在每个管中重新悬浮细胞。
注：如果最好进行 MCS 分拣，CD11b 珠子可用于在去除骨髓后选择微胶质和其他骨髓细胞。然后，这些细胞可用于非基于板的scRNA-seq以及散装RNA-seq。这种替代方法的警告是，CD11b珠子不会将微胶质与其他相关的免疫细胞分离，而这些免疫细胞也对这种抗原呈阳性。
5. 荧光激活细胞分拣的染色
注：此步骤需要约 40 分钟。
- 在每个管中加入5μL的小鼠Fc受体块试剂（材料表）。在冰上孵育5分钟。
- 将 1 μL CD45-PE-Cy7 和 1 μL CD11b-BV421 添加到每个管中。
注：可与其他结合的荧光光道使用抗体。针对TMEM119的抗体，一种用于静温微胶质9的特定标记物，也可以包括在内，但建议与CD45和CD11b一起使用，因为某些微胶亚亚体群可能会失去TMEM119表面表达。 - 在室温 （RT） 下在摇床上孵育管子 10 分钟。
- 添加 2 mL 的 FACS 缓冲液进行洗涤。
- 4°C的颗粒细胞，400 x g，5分钟。缓慢倒出上清液，在纸巾上涂抹管的边缘。使用 400 μL 的 FACS 缓冲液，使用 1 μL 的 RNase 抑制剂和 0.5 μL 的碘化钠（PI，1：1，000 稀释）在每个管中重新悬浮细胞。
6. 索引 FACS 排序
注：此步骤应需要 ±1 小时。
- 遵循标准FACS程序，根据散射（不包括碎片）、单细胞、活细胞（PI负数）、微胶质和骨髓细胞（CD45+，CD11b+）绘制闸门。
注：典型的微胶质细胞表达CD45在较低的水平相比，与其他边界相关的巨噬细胞，如血管和脑咽，因此门在CD45低CD11b-应该足够，如果研究的重点是基因表达配置文件在这些经典的微胶质1，2。然而，微胶质的某些子集可能具有更高的CD45表达，这在发育或疾病条件下尤其如此。为了确保对微胶质基因表达的无偏见分析，CD45高免疫表型和CD45低免疫表型可以通过指数分集设置和采集的两个人群进行测序和下游分析。此外，TMEM119表面表达可用于靶向静动微胶质总体（参见步骤5.2），并与CD45水平和测序结果一起进行分析。 - 将单个微胶质（带 100 μm 喷嘴）分类到 96 孔聚合酶链反应 （PCR） 板中，每个孔包含 4 μL 的莱沙缓冲液（详情见已发布的协议14）。
注：外部RNA控制联盟（ERCC）RNA尖刺混合（材料表）可以在1：2.4 x 107的莱沙缓冲液中加入，用于质量控制和正常化目的2。 - 使用台式离心机短暂涡旋板并旋转。
- 立即将样品冷冻在干冰上。将盘子储存在-80°C，直到库准备。
注：或者，更多的细胞可以收集到1.5 mL管中，用RNA提取缓冲液进行散装RNA-seq。根据作者的经验，3000个细胞足以在已发布的协议2，14之后生成高质量的库。
7. 单细胞RNA测序库制备
注：在这里，遵循已发布的协议14，在液体处理机器人和一些修改的帮助下生成scRNA-seq库。在本文中，仅简要描述了该过程，并突出显示了差异。同时处理4个盘子大约需要2.5天。
- 在冰上解冻板，用Oligo-dT30VN底漆（在发散缓冲液中）进行逆转录，用热循环器生成cDNA（表1：42°C 90分钟）;70 °C 5 分钟;4 °C 保持。然后用PCR主混合物和原位PCR（ISPCR）引物（材料表）和以下PCR条件（37°C 30分钟）在开始时用额外的外糖酶消化步骤扩增cDNA（表2）;95 °C 3 分钟;23 周期 98 °C 20 s、67 °C 15 s、72 °C 4 分钟;72 °C 5 分钟
- 每井使用 18 μL 的磁珠（0.7：1 比率）纯化 cDNA。在磁性支架上孵育板 5 分钟，每次用新鲜制作的 80% 乙醇、每口 80 μL 清洗样品两次。干燥板 15-20 分钟后，每孔洗脱缓冲液为 20 μL 的洗脱 cDNA。
注：对于质量控制，使用片段分析仪（高灵敏度的下一代测序 [NGS] 片段分析，1⁄6，000 bp）来检查 cDNA 的大小分布和浓度，并且仅进一步处理涂片在 500~5，000 bp 之间且高于 0.05 纳克/μL 的样品。 - 要生成文库，在 55°C 10 分钟时，将每个 cDNA 样品的 0.4 μL 与来自库制备试剂盒（材料表）的 1.2 μL Tn5 标记试剂混合在 384 孔板中。
注：在这里，添加建议的反应体积的1/12.5（5μL样品和15μL的标记试剂），以降低成本，同时增加产量。纳米升移液机（材料表）用于将试剂（本和以下步骤）从384孔板转移到384孔板。 - 加入0.4 μL的中和缓冲液，以停止RT的标记反应5分钟。
- 添加 384 个索引（材料表，0.4 μL 正向和 0.4 μL 反向），1.2 μL PCR 混合物到样品中（每个 2 μL），并使用以下条件放大库：72 °C 3 分钟;95 °C 30 s;10个周期 95 °C 10 s，55 °C 30 s，72 °C 1 分钟;72 °C 5 分钟
- 将同一 384 孔板中的所有单个库（每块 1 μL）集中起来，并使用磁珠（材料表，0.7：1 比率）来净化最终的池库。
- 使用荧光计（材料表）测量浓度，使用生物分析仪（材料表）在测序前检查集合库的大小分布。将测序深度定位于每个单元 100 万次原始读取。
- 遵循标准生物信息学程序来过滤和修剪测序读取和执行对齐2。使用计数表和元数据作为输入，使用 Seurat 包15进行聚类分析。
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Representative Results
该协议描述了一种在一个成人注入脑半球中从不同大脑区域分离和排序微胶质的方法，然后是scRNA-seq。我们使用点心来创建单个细胞悬浮液，并作为丰富微胶质的第一步。不足或过度采用会降低产量。此外，成年小鼠大脑含有高水平的骨髓，如果去除不当，也会降低分拣效率和产量。因此，在进行抗体染色之前，我们使用锥蓝色锥形和血细胞计来估计骨髓去除的产量、细胞活力和疗效（步骤4.9），在显微镜下检查细胞悬浮液（图1）。此时，皮层的总细胞计数应超过 30，000，其他组织超过 5，000。超过90%的细胞应该在小骨髓碎片下存活。
我们使用FACS机器对微胶质（或骨髓细胞）进行分类，这些微胶质细胞通常是CD45低和CD11b阳性。至少对于皮质组织，成功的分离应该产生超过80%的微胶质从所有活的单细胞（图2）。死亡/死亡人口只占制剂的一小部分（约10%）。
一旦单个微胶质被捕获到解液缓冲液中，RNA被释放，然后反向转录到cDNA，然后被放大23个周期。在创建库之前，检查这些 cDNA 样本的质量（至少是其中的一部分）非常重要。作为毛细管电泳平台，片段分析仪和高灵敏度 NGS 片段试剂盒 （1⁄6，000 bp） 提供有关尺寸分布以及 96 孔板每个孔中存在于每个孔中的 cDNA 分子数量的快速准确信息（图3A）。显示涂片（500~5，000 bp）和超过特定浓度阈值（例如，0.05纳克/μL）的样品可用于制作库。同样，在测序之前，应在生物分析仪上测试池库（图3B）。
我们测序样本的深度超过每细胞100万原始读取，这饱和了这个scRNA-seq方法16的检测能力。以约60%的映射率，每个微胶质细胞可以检测到超过2，000个基因。我们获得了使用这种分离方法17生成的已公布的数据，并证明了其通过独立实验的可重复性，以及检测测序总体中微胶原基因的敏感性（图4）。
图1：微胶质分离产量、细胞活力和骨髓去除效率的估计。左面板显示锥形蓝色染色细胞（从皮层）穿过骨髓去除柱后的明亮场图像（4倍放大率）。其他区域的结果看起来相似，但单元格较少。绝大多数（如果不是全部）细胞出现明亮（非染色）和圆形由于过程损失。右图为盒装区域的放大（20x），存在小骨髓碎片。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用于对微胶质进行排序的盖茨。数据显示了从皮层对微胶质进行分类的浇注策略，其他区域也采用了同样的策略。首先将细胞碎片排除在散射图之外，单个单元通过正向散射区域（FSC-A）/正向散射宽度（FSC-W）封闭。活细胞被PI阴性染色封闭，大约90%来自所有单个细胞。微胶质，代表大约80%的活细胞，从CD45低CD11b+门排序。总共30，000个微胶质可以从皮层组织（从一只3个月大的老鼠的一个半球）中分离出来和分类。在 FACS 计算机上执行索引排序。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：从单个微胶质细胞和最终的池化库中扩增cDNA的代表性质量控制结果。（A） 使用片段分析仪，所有片段均以其大小在 X 轴上绘制，并在 Y 轴上绘制相对荧光强度，表示给定大小的 cDNA 的丰度。LM（下标记，1 bp）和UM（上标记，6，000 bp）是载荷标记，已知浓度用于测量cDNA数量。从代表性的微胶质细胞成功放大cDNA，在尺寸分布图上形成曲线（绿色虚线），或在凝胶图上形成500 bp和5，000 bp之间的涂片（标记支架）。其他标记的峰被放大从ERCC尖刺分子或核糖体RNA。cDNA在500 bp和5，000 bp之间的浓度可以量化，那些浓度高于0.05纳克/μL并显示这些典型曲线的样品保留用于库制备。RFU，相对荧光单位。（B） 生物分析仪上的代表性质量控制结果，显示最终池库（约380个细胞）的大小分布。通常，其范围从 200 bp 到 2，000 bp，平均大小为 400–600 bp。两个尖峰是加载标记。FU，荧光单元。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：从两只雄性小鼠的4个大脑区域分离出微胶质的scRNA-seq分析。（A） tSNE 图显示了区域微胶质的混合模式（仅突出显示了来自小鼠#1的细胞）。它们不会根据区域原点形成不同的聚类，而是微妙地转移到 tSNE 图上的集中区域（可能是由于批处理效应）。这一观察与基于成年小鼠全球基因表达的微胶质有限的区域异质性一致（见最近出版的第2号出版物，进一步讨论这一专题）。（B） tSNE 图显示了两个独立处理的小鼠的微胶质重叠模式。虽然可能存在小批量效应（细胞集中在绘图的某些区域），但这些细胞不会根据动物来源形成不同的簇。这一结果表明了实验间数据比较协议的可重复性。（C） sRNA-seq检测到的微胶合体特征基因的表达，表明特定标记（如Tmem119和P2ry12）的检测率超过95%，已知转录因子（如Sall1和Pu.1）的检测率超过80%。这些数据被重新分析从已发表的文献17。（D） 绝大多数孤立的微胶质缺乏特定于其他细胞类型的基因的表达，如Tubb3（神经元）、Aldh1l1（星形细胞）、Gjb1（寡核细胞）和Tie1（内皮细胞）。（E） 表达基因相关的微胶质活化或应激。经典标记，Tnf，Il1b，Nos2和Nfkb2，这些标记是低表示的，显示在顶部。 早期反应基因Egr1和Fos显示在底部（见讨论）。请点击此处查看此图的较大版本。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| 细胞莱沙 | 4 |
| 逆转录酶 （100 U/μL） | 0.95 |
| Rnase抑制剂 | 0.25 |
| 5x 第一股缓冲液 | 2 |
| 二硫硫醇（DTT;100 mM） | 0.5 |
| 贝塔因 （5 M） | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| 模板开关寡聚物（TSO;100 μM） | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| 总 | 10 |
表1：反向转录条件。提供一个逆转录反应的试剂体积。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| 反向转录产品 | 10 |
| 2x PCR 主组合 | 12.5 |
| ISPCR 引漆 （10 μM） | 0.25 |
| 兰姆达外塞 | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| 总 | 25 |
表2：PCR扩增条件。提供一个PCR从单个细胞中扩增cDNA的试剂体积。
| 基于板（此协议） | 基于滴（10倍基因组学） | |
| 灵敏度 | 检测到更多基因 | 检测到的基因更少 |
| 全长 | 是的 | 否（5' 或 3' 结束） |
| 细胞数/人口的灵活性 | 适合小或罕见亚种群的表征 | 适用于大细胞群的广泛分类 |
| 吞吐量 | 多达数千个单元格 | 数以百到数万个细胞 |
| 唯一分子标识符 | 不 | 是的 |
| 每个单元格的成本 | $1+$5 | 少于 $1 |
| 实验难度 | 步骤更多，通常需要液体处理机器人 | 易于使用商业化机器执行 |
| 细胞群 | 由 FACS 排序定位 | 公正 |
表3：基于板和滴的scRNA-seq方法的比较。本文提供了基于板的全长scRNA-seq程序，具有灵敏度高、全长测序和柔性为少量细胞作为输入的优点。基于滴滴的方法具有吞吐量高、成本低、易于执行和独特的分子标识符数据等优点。根据实验的目的，它们是互补的。
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Discussion
微胶质积极与中枢神经系统中的其他细胞类型相互作用，并且对环境刺激非常敏感。为了尽量减少在分离过程中其基因表达的炎症反应和异常变化，该协议从先前公布的方法9进行了简化，现在适合从单个小鼠大脑半球的多个区域并行分离微胶质。组织和试剂保存在低温下，实验及时进行（从解剖到分拣约3.5小时），根据有限的组织尺寸，处理次数更少，试剂较少。我们选择其他同质化方法，如酶消化，因为机械解散可以杀死，从而去除神经元和其他胶质细胞，同时对微胶质9，18造成很少的损害或激活。然而，过度的加法可能会降低微胶质的产量，应该避免。此前已经表明，机械解离和基于珠子的骨髓去除，然后FACS排序引入较少的激活微胶，基于经典炎症基因的最小表达，例如，Tnf，Il1b，Nos2和Nfkb2 9（图4E）。 尽管如此，微胶质在分离和分拣过程中仍然能够对前体条件做出反应，通过调节早期反应基因（如图4E），这些基因通常不用体内的微胶质2、19表示，转录组研究的这种变化应始终在组织学部分得到验证。
在这里，我们提供从成年小鼠大脑半球分离微胶质从皮层、小脑、海马和纹状体的程序，并且此协议可以很容易地适应其他区域或阶段。这适用于受疾病影响的微胶质，例如，当受疾病影响的微胶质仅限于大脑中可解剖的某些区域时，或在老化研究中，因为明显的个体变异而不宜汇集样本。随着对微胶质（或泛先天免疫）表位的抗体的可用性，此方案也可以适用于在大鼠或人体组织中分离微胶质9。调整较大或较旧的组织时，必须考虑并测试骨髓去除珠的体积和使用柱的类型。去除骨髓的另一种方法是在商业低粘度介质20中通过密度梯度离心。总体而言，这两种方法在效率上是可比的，虽然密度梯度离心方法可以提供略高的产量，另一方面，磁珠法不太可能引入内毒素，这可能激活微胶质21，22。
由于微胶质在总脑细胞中所占的比例很小，因此在进行单细胞转录组研究之前，通常必须丰富或纯化微胶质。我们使用 FACS 作为捕获低表示细胞类型的敏感方法，并根据 CD11b 和 CD45 表面表达式选择微胶质。从一个半球，我们经常获得30，000欧元皮层微胶质，以及5，000欧元小脑、海马或纹状体微胶质。这些产量足以满足大多数单细胞应用以及散装RNA-seq（3，000个或更多细胞可以使用）。值得一提的是，微胶质在发育或疾病2期间可能提高CD45免疫反应，在这种情况下，CD45的低和高水平的细胞应该被记录和索引排序进行分析。丰富微胶质的另一个选项是使用CD11b珠介导的磁活细胞分类后，骨髓素去除，但这将限制scRNA-seq滴的方法。
为了研究单细胞分辨率的微胶质基因表达，我们通常将每个样本的细胞分类到至少2~3个96孔板中，并用液体处理机进行库制备。研究表明，这种基于板的全长库制备方法是检测极限中最灵敏的scRNA-seq方法之一，可以精确定量稀有的抄本，如转录因子13、14、16。由于全长测序，这种方法不受 5' 或 3' 偏差的影响，可用于分析拼接变体（表 3）。此外，与反应中通常需要数百或数千个细胞的滴滴方法不同，这种基于板的协议具有灵活性，在每个实验中包括少量细胞，并在以后在设计中添加更多板来逐渐扩大总体大小。这在某些条件下（如胚胎发育）下研究微胶质的小子集是有利的。
虽然该协议可重复为大脑区域微胶质生成高质量的 scRNA-seq 库，但由于成本相对较高（用于图书馆准备，大约 5 美元/单元，如果使用现成的 SmartSeq v4 套件，它仍然比 23 美元/单元便宜），因此通常只适合小规模研究。多种策略可以帮助降低成本和增加吞吐量。首先，细胞可以分拣到384孔板中，只需0.5μL的赖沙缓冲液，而初始逆转录和PCR扩增步骤只需要1/8卷试剂。其次，可以生产内部Tn5转塞酶，其质量与商用套件23中的质量相似。这两项修改可将库准备成本降低到 1 美元/单元。第三，使用自定义索引，数千个细胞可以汇集在一起，在系统上进行测序，而不会牺牲测序深度（>100万次读取/单元）17。这些改进以及自动液体处理机器人的加入，将使从几乎任何定义区域分离出高通量的深scRNA-seq微胶质。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢玛丽科·贝内特、利亚娜·妮可·博南诺和斯皮罗斯·达尔马尼斯在制定该协议期间提供的帮助。我们还感谢斯坦福共享FACS设施，特别是梅雷迪斯·韦格拉兹和丽莎·尼科尔斯;来自斯坦福蛋白质和核酸设施（PAN）的Yen Tran，迈克尔·埃卡特，因为他们对拍摄的大力支持。这项工作由JPB基金会和文森特·科茨基金会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
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