Родной Полякриламимид Гель Электрофорез Иммуноблот Анализ эндогенной димеризации IRF5
Summary
Описан родной западный метод поблуждения для анализа эндогенного интерферона регулятивного фактора 5 димеризации в плазмоцитной дендритной линии CAL-1. Этот протокол может быть применен и к другим клеточным линиям.
Abstract
Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является ключевым фактором транскрипции для регулирования иммунного ответа. Он активируется вниз по течению Toll-как рецептор миелоидной дифференциации первичного источника ответа гена 88 (TLR-MyD88) сигнальный путь. Активация IRF5 включает в себя фосфорилирование, димеризацию и последующее перемещение из цитоплазмы в ядро, что, в свою очередь, индуцирует экспрессию генов различных провоспалительных цитокинов. Для изучения функций IRF5 и соответствующих путей необходимо провести ажиотаж обнаружения активации IRF5. В этой статье описывается надежный анализ для обнаружения эндогенной активации IRF5 в плазмоцитной дендритной клетке CAL-1 человека (pDC). Протокол состоит из модифицированного анализа электрофорезов nondenaturing, который может различать IRF5 в его мономерных и димерных формах, обеспечивая тем самым доступный и чувствительный подход к анализу активации IRF5.
Introduction
Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является важным регулятором транскрипции, который играет заметную роль в регулировании иммунного ответа, особенно в выпуске провоспалительных цитокинов и интерферонов типа I (IFNs)1,2 ,3. Неправильное регулирование IRF5 является фактором, способствующим многочисленным аутоиммунным заболеваниям, о чем свидетельствуют различные полиморфизмы в локусе IRF5, связанные с системной эритематозом волчанки, рассеянным склерозом, ревматоидным артритом и т.д.4, 5,6,7,8,9,10. Таким образом, надежный детектор обнаружения эндогенного состояния активации IRF5 имеет решающее значение для понимания регуляторных путей и ниже по течению эффектов IRF5 в физиологически актуальном клеточном контексте.
IRF5 является составным образом выражается в моноцитах, дендритных клетках (ДК), В-клетках и макрофагах1,11. Как и в других факторах транскрипции семьи IRF, IRF5 находится в цитоплазме в ее скрытом состоянии. После активации IRF5 фосфорилировался и образует гомодимеры, которые затем перемещаются в ядро и связываются с определенными регуляторными элементами генов, кодирующих тип I IFNs и провоспалительных цитокинов, что в конечном итоге приводит к экспрессии этих генов1 ,2,11,12,13. IRF5 регулирует врожденные иммунные реакции вниз по течению различных платных рецепторов (TLRs), таких как TLR7, TLR 8 и TLR 9, которые локализованы в эндосомомых и используют MyD88 для сигнализации1,11,14. Эти TLRs в первую очередь признают иностранные виды нуклеиновой кислоты, такие как одноцепочечная РНК (ssRNA) и неметилированные CPG ДНК, которые являются симптомами инфекции15,16,17,18. Было показано, что IRF5 регулирует иммунные реакции против бактериальных, вирусных и грибковых инфекций19,20,21. Учитывая влиятельную и разнообразную роль IRF5 в иммунной системе, повышение или увлажнение активности IRF5 может послужить новым средством для развития терапевтических агентов22. Поэтому крайне важно разработать протокол для мониторинга состояния активации эндогенного IRF5, с тем чтобы обеспечить тщательное исследование путей и механизмов, регулирующих активность IRF5 в различных типах клеток.
Насколько нам известно, до разработки этого протокола не было опубликовано ни одного биохимического или гелевого электрофоретического анализа для эндогенной активации IRF5. Фосфорилирование было показано, что важный первый шаг активации IRF5, и фосфоспецифические антитела IRF5 был разработан, что привело к открытию и подтверждению остатков serine важно для IRF5 деятельности13. Однако, в то время как антитела четко обнаруживает фосфорилированный IRF5, когда иммунопроцирование или overexpressed23, он не может обнаружить IRF5 фосфорилирования в целом лизат клеток в наших руках (данные не показаны). Димеризация является следующим шагом активации IRF5, и многие важные исследования на сегодняшний день расследование этого шага опирался на переэкспрессию эпитоп-тегами IRF5, часто в нерелевантных типов клеток, которые обычно не выражают IRF511,12 ,24,25. Предыдущие исследования показали, что димеризированный IRF5 не всегда может трансвесироваться в ядро и, следовательно, не обязательно полностью активирован25,26. Анализ эндогенной локализации ядерной энергии IRF5 был разработан для оценки активации IRF5 с помощью цитометрии потока изображений27. Этот ассеия была применена в исследованиях, которые имеют решающее значение для понимания активности IRF5, особенно в первичных или редких типах клеток28,29 и значительно продвинули знания в этой области. Однако этот асси опирается на специализированный инструмент, который не пользуется широкой доступностью для исследователей. Кроме того, часто необходимо исследовать начальные этапы активации при вскрытии регуляторных путей IRF5 и выявлении восходящих регуляторов и компонентов путей. Это исследование обеспечивает надежный и надежный биохимический анализ для ранних событий активации IRF5, которые могут быть выполнены в лабораториях, оснащенных молекулярной биологией инструментов. Описанный здесь протокол будет очень полезен при изучении путей и механизмов действий IRF5, особенно в сочетании с ортогональными ассиями, такими как цитометрический анализ циклометрического анализа ядерных локализации IRF523, 27,28,30.
Родной полиакриламид гель электрофорез (родной PAGE) является широко используемым методом для анализа белковых комплексов31,32. В отличие от натрия dodecylsulfate полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE), родной PAGE отделяет белки на основе их формы, размера и заряда. Он также сохраняет родную структуру белка без денатурации31,33,34,35. Представленный протокол использует эти особенности родного PAGE и обнаруживает как мономерные, так и димерические формы IRF5. Этот метод особенно важен для обнаружения ранних событий активации, поскольку нет подходящих коммерчески доступных антител, которые могут обнаружить эндогенные фосфорилированные IRF5. Ранее несколько опубликованных исследований использовали родной PAGE для оценки iRF5 димеризации. Тем не менее, большинство из этих исследований зависело от переэкспрессии экзогенных эпитопных меток IRF5 для анализа состояния активации2,13,24,36,37 . Эта работа представляет пошаговый протокол для анализа эндогенных IRF5 димеризации с помощью модифицированной родной техники PAGE в плазмоцитной дендритной клетки человека (pDC) линии, где IRF5 деятельности было показано, что решающее значение для его функции1, 38,39,40. Этот же метод был применен к другим клеточным линиям23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол представляет собой модифицированный родной PAGE, который отличает как мономерные, так и димерические формы эндогенных IRF5. Там было несколько исследований, сообщающих об обнаружении эндогенной активации IRF5 с использованием специализированных методов цитометри…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана финансированием из Фонда Краучера и стартап-фондов Городского университета. Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Чоу за помощь в эксперименте и критическое чтение рукописи.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. 생화학. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
