Nativa Polyacrilamide Gel Elettroforresis Immunoblot Analisi immunoblot di dimerazione Endogena IRF5
Summary
Viene descritto un metodo nativo western blot per l’analisi del fattore regolatore dell’interferone endogeno 5 nella linea cellulare dendritica plasmacitoide CAL-1. Questo protocollo può essere applicato anche ad altre linee cellulari.
Abstract
Il fattore regolatore dell’interferone 5 (IRF5) è un fattore chiave di trascrizione per la regolazione della risposta immunitaria. Viene attivato a valle del percorso di segnalazione del gene di segnalazione del gene di segnalazione 88 (TLR-MyD88) del recettore toll-like mieloide. L’attivazione dell’IRF5 comporta fosfororylazione, dimerizzazione e successiva traslocazione dal citoplasma al nucleo, che a sua volta induce l’espressione genica di varie citochine pro-infiammatorie. Un risultato di rilevamento per l’attivazione IRF5 è essenziale per studiare le funzioni IRF5 e i relativi percorsi. Questo articolo descrive un robusto analisi per rilevare l’attivazione endogena IRF5 nella linea di cellule dendriche (pDC) plasmacitoide umane CAL-1. Il protocollo consiste in un saggio di elettroforesi non denatura modificato in grado di distinguere IRF5 nelle sue forme monomeriche e dimeiche, fornendo così un approccio conveniente e sensibile per analizzare l’attivazione IRF5.
Introduction
Il fattore regolatore dell’interferone 5 (IRF5) è un importante regolatore di trascrizione che svolge un ruolo di primo piano nella regolazione della risposta immunitaria, in particolare nel rilascio di citochine pro-infiammatorie e interferissi di tipo Ioni (IFN)1,2 ,3. La miscisazione della IRF5 è un fattore che contribuisce a numerose malattie autoimmuni, come evidente da vari polimorfismi nel locus IRF5 che sono associati con lupus erithematosos sistemico, sclerosi multipla, artrite reumatoide,ecc. 4, 5,6,7,8,9,10. Pertanto, un robusto test di rilevamento per lo stato di attivazione Endogeno IRF5 è fondamentale per comprendere i percorsi normativi e gli effetti a valle dell’IRF5 in un contesto cellulare fisiologicamente rilevante.
IRF5 è esclusivamente espresso in monociti, cellule dendritiche (DC), cellule B e macrofagi1,11. Come per altri fattori di trascrizione familiare IRF, l’IRF5 risiede nel citoplasma nel suo stato latente. Al momento dell’attivazione, IRF5 viene fosfolato e forma omodimeri, che poi si traslocano nel nucleo e si legano a specifici elementi regolatori di geni che codificano gli IFN di tipo I e le citochine pro-infiammatorie, inducendo infine l’espressione di questi geni1 ,2,11,12,13. IRF5 regola le risposte immunitarie innate a valle di vari recettori simili a pedoni (TLR), come TLR7, TLR 8 e TLR 9, che sono localizzati in endosomi e utilizzano MyD88 per la segnalazione1,11,14. Questi TLR riconoscono principalmente specie di acido nucleico estraneo come l’RNA a filamento (ssRNA) e il DNA CpG non metilato che sono sintomatici di un’infezione15,16,17,18. IRF5 ha dimostrato di regolare le risposte immunitarie contro le infezioni batteriche, virali e fungine19,20,21. Considerando il ruolo influente e diversificato della IRF5 nel sistema immunitario, migliorare o smorzare l’attività dell’IRF5 potrebbe servire come nuova strada per lo sviluppo di agenti terapeutici22. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo per monitorare lo stato di attivazione dell’IRF5 endogeno per consentire un’indagine approfondita dei percorsi e dei meccanismi che regolano l’attività IRF5 in diversi tipi di cellule.
Per quanto ne sappiamo, non è stato pubblicato alcun saggio biochimico o gel elettroforetico per l’attivazione endogena iRF5 prima dello sviluppo di questo protocollo. Il phosphorylation è stato dimostrato come un primo passo importante dell’attivazione IRF5, ed è stato sviluppato un anticorpo IRF5 fosforo specifico che ha portato alla scoperta e alla conferma di un residuo di serino importante per l’attività IRF513. Tuttavia, mentre l’anticorpo rileva chiaramente l’IRF5 fosforelare quando è immunoprecipitato o sovraespresso23, non riesce a rilevare la fosforilazione IRF5 in un’intera lisata cellulare nelle nostre mani (dati non mostrati). La dimerizzazione è il prossimo passo dell’attivazione IRF5, e molti studi importanti fino ad oggi studiando questo passo si basavano sulla sovraespressione dell’IRF5 con tag epitopi, spesso in tipi di cellule irrilevanti che normalmente non esprimono IRF511,12 ,24,25. Studi precedenti hanno dimostrato che l’IRF5 dimerizzato non sempre può traslocare nel nucleo e quindi non è necessariamente completamente attivato25,26. È stato sviluppato un saggio per la localizzazione nucleare IRFa Endogena per valutare l’attivazione di IRF5 mediante citometria del flusso di imaging27. Questo saggio è stato applicato in studi che sono stati cruciali per comprendere l’attività IRF5, soprattutto nei tipi di cellule primarie o rare28,29 e notevolmente avanzato la conoscenza nel campo. Tuttavia, questo saggio si basa su uno strumento specializzato che non è ampiamente disponibile per i ricercatori. Inoltre, è spesso necessario studiare le fasi iniziali dell’attivazione, sezionando i percorsi normativi IRF5 e identificando i regolatori a monte e i componenti del percorso. Questo studio fornisce un saggio biochimico robusto e affidabile per i primi eventi di attivazione dell’IRF5 che può essere eseguito in laboratori dotati di strumenti di biologia molecolare. Il protocollo qui descritto sarà molto utile per studiare i percorsi e i meccanismi delle azioni IRF5, soprattutto se combinato con saggi ortogonali come l’analisi citometrica del flusso di immagini della localizzazione nucleare IRF523, 27,28,30.
L’elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (nativa PAGE) è un metodo ampiamente utilizzato per analizzare i complessi proteici31,32. A differenza dell’elettroforesi gel in gel di sodio dodecylsulfate (SDS-PAGE), PAGE nativo separa le proteine in base alla loro forma, dimensione e carica. Mantiene anche la struttura originaria delle proteine senza denaturazione31,33,34,35. Il protocollo presentato sfrutta queste caratteristiche della PAGE nativa e rileva sia forme monomeriche che dimericiche di IRF5. Questo metodo è particolarmente importante per rilevare gli eventi di attivazione precoce perché non esiste un anticorpo disponibile in commercio adatto in grado di rilevare l’IRF5 fosforogeno endogeno. In precedenza, diversi studi pubblicati hanno usato PAGE nativo per valutare la dimerizzazione IRF5. Tuttavia, la maggior parte di questi studi dipendeva dalla sovraespressione dell’IRF5 con tag epitope esogeni per analizzare lo stato di attivazione2,13,24,36,37 . Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per l’analisi della dimerizzazione iRFosa endogena tramite una tecnica PAGE nativa modificata in una linea di cellule dendritiche plasmacitoidi umane (pDC), dove l’attività IRF5 ha dimostrato di essere cruciale per la sua funzione1, 38,39,40. Questa stessa tecnica è stata applicata ad altre linee cellulari23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è una PAGE nativa modificata che distingue sia le forme monomeriche che dimericiche di IRF5 endogeno. Ci sono stati pochi studi che riportano il rilevamento dell’attivazione endogena IRF5 utilizzando la tecnica specializzata della citometria del flusso di immagini23,27,28,30. Questo protocollo utilizza una tecnica comune e reagenti e strumenti comuni per valutare lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dai fondi della Fondazione Croucher e della City University. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Chow per l’aiuto con l’esperimento e la lettura critica del manoscritto.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
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