내인성 IRF5 이분화의 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동동면역블롯 분석
Summary
CAL-1 혈장세포세포주에서 내인성 인터페론 조절 인자 5 이량화를 분석하기 위한 네이티브 웨스턴 블롯 방법이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 다른 세포주에도 적용될 수 있습니다.
Abstract
인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응을 조절하기 위한 주요 전사 인자이다. 그것은 톨-유사 수용체 골수성 분화 1차 반응 유전자 88(TLR-MyD88) 신호 통로의 하류로 활성화된다. IRF5 활성화는 세포질에서 핵으로의 인산화, 이량화 및 후속 전좌를 수반하며, 이는 차례로 다양한 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 유도한다. IRF5 활성화를 위한 검출 분석은 IRF5 기능 및 관련 경로를 연구하는 데 필수적입니다. 본 문서에서는 CAL-1 인간 혈장세포 수지상세포(pDC) 라인에서 내인성 IRF5 활성화를 검출하는 강력한 분석법들을 기술한다. 이 프로토콜은 단량체 및 이량체 형태로 IRF5를 구별할 수 있는 변형된 비분진 전기 동공 분석법으로 구성되어 IRF5 활성화를 분석하는 저렴하고 민감한 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 면역 반응 조절에 중요한 전사 조절제이며, 특히 염증성 사이토카인 및 I형 인터페론(IFN)의 방출에서 특히 두드러진 역할을합니다. ,3. IRF5의 오질은 전신 성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 등과 관련된 IRF5 궤적의 다양한 다형성에 의해 명백한 바와 같이 수많은 자가면역 질환에 기여하는 요인입니다4. 5,6,7,8,9,10. 따라서, 내인성 IRF5 활성화 상태에 대한 강력한 검출 분석은 생리학적으로 관련된 세포 맥락에서 IRF5의 조절 경로 및 다운스트림 효과를 이해하는 데 매우 중요하다.
IRF5는 단핵구, 수지상 세포(DC), B 세포 및 대식세포1,11로구성적으로 발현된다. 다른 IRF 가족 전사 요인과 마찬가지로, IRF5는 잠복 상태에서 세포질에 상주합니다. 활성화 시, IRF5는 인산화되고 호모머를 형성하며, 핵으로 옮기고 I IFN 유형과 염증성 사이토카인을 코딩하는 유전자의 특정 조절 요소에 결합하여 결국 이러한 유전자의 발현을유도합니다 1 ,2,11,12,13. IRF5는 Endosomes에 국한되어 있는 TLR7, TLR 8 및 TLR 9와 같은 다양한 톨-유사 수용체(TLR)의 선천적 면역 반응을 조절하고신호 1,11,14에MyD88을 사용한다. 이러한 TLRs는 주로 감염15,16,17,18의증상인 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 미수정 CpG DNA와 같은 외래 핵산 종을 인식한다. IRF5는 세균, 바이러스성 및 곰팡이 감염에 대하여 면역 반응을 조절하기 위하여 보였습니다19,20,21. 면역 계통에 있는 IRF5의 영향력 있고 다양한 역할을 고려하면, IRF5 활동을 강화하거나 감쇠하는 것은 치료제22의발달을 위한 새로운 도로역할을 할 수 있었다. 따라서, 다른 세포 유형에서 IRF5 활성을 조절하는 경로 및 메커니즘에 대한 철저한 조사를 허용하기 위해 내인성 IRF5의 활성화 상태를 모니터링하는 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.
우리의 지식의 베스트에, 내인성 IRF5 활성화를 위한 생화확적인 또는 젤 전기 동체 분석제는 이 프로토콜의 발달 의 앞에 간행되었습니다. 인산화는 IRF5 활성화의 중요한 첫 번째 단계인 것으로 나타났으며, 인광특이적 IRF5 항체는 IRF5 활성13에중요한 세린 잔기의 발견 및 확인을 이끌어 낸 것으로 개발되었다. 그러나, 항체가 면역침전 또는 과발현23때인산화된 IRF5를 명확하게 검출하는 동안, 우리 손에서 전체 세포 에서 IRF5 인산화를 검출하지 못한다(데이터는 도시되지 않음). 이분화는 IRF5 활성화의 다음 단계이며, 이 단계를 조사하는 많은 중요한 연구는 일반적으로 IRF511,12를 표현하지 않는 관련이없는 세포 유형에서 종종 에피토프 태그가 달린 IRF5의 과발현에 의존했습니다. ,24,25. 이전 연구는 이분화 된 IRF5가 항상 핵으로 전이되지 않을 수 있으므로 반드시 완전히 활성화되지는 않는 것으로 나타났습니다25,26. 내인성 IRF5 핵 국소화를 위한 분석실험은 영상유세포분석(27)에의한 IRF5 활성화를 평가하기 위해 개발되었다. 이 분석은 IRF5 활성을 이해하는 데 결정적인 연구에서 적용되었으며, 특히 1차 또는 희귀 세포 유형28,29에서 이 분야의 지식을 크게 발전시켰습니다. 그러나, 이 분석은 연구원에게 널리 유효하지 않은 전문화한 계기에 의존합니다. 또한 IRF5 규제 경로를 해부하고 업스트림 레귤레이터 및 경로 구성 요소를 식별하는 동안 초기 활성화 단계를 조사해야 하는 경우가 많습니다. 이 연구는 분자 생물학 도구가 장착 된 실험실에서 수행 할 수있는 IRF5의 초기 활성화 이벤트에 대한 강력하고 신뢰할 수있는 생화학 분석을 제공합니다. 여기서 설명된 프로토콜은 IRF5 핵 국소화23의 이미징 흐름 세포 측정 분석과 같은 직교 분석과 결합될 때 특히 IRF5 작용의 경로 및 메커니즘을 조사하는 데 매우 유용할 것입니다. 27,28,30.
네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기동공 (native PAGE)은 단백질복합체(31,32)를분석하는 데 널리 사용되는 방법이다. 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)과는 달리 네이티브 PAGE는 모양, 크기 및 전하에 따라 단백질을 분리합니다. 또한 변성 없이 기본 단백질 구조를 유지31,33,34,35. 제시된 프로토콜은 네이티브 PAGE의 이러한 기능을 활용하고 IRF5의 단조및 조준체 형태를 모두 감지합니다. 이 방법은 내인성 인광IRF5를 검출할 수 있는 적합한 시판 항체가 없기 때문에 조기 활성화 이벤트를 검출하는 데 특히 중요합니다. 이전에는 네이티브 PAGE를 사용하여 IRF5 이분화를 평가하는 여러 연구가 발표되었습니다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 활성화 상태를 분석하기 위해 외인성 에피토프 태그 IRF5의 과발현에 의존2,13,24,36, 37 . 이 작품은 인간 혈장 세포 수지상 세포 (pDC) 라인에서 수정 된 네이티브 PAGE 기술을 통해 내인성 IRF5 이량 분석을 분석하기위한 단계별 프로토콜을 제시하며, 여기서 IRF5 활성은 그 기능에 중요한 것으로 나타났습니다1, 38,39,40. 이 와 같은 기술은 다른세포주(23)에적용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 내인성 IRF5의 단일및 다이메라체 형태를 모두 구별하는 수정된 네이티브 PAGE이다. 전문 적인 화상 진찰 교류 세포분석 기술23,27,28,30를사용하여 내인성 IRF5 활성화의 검출을 보고하는 몇몇 연구 결과가 있었습니다. 이 프로토콜은 일반적인 기술과 일반적인 시약 및 도구를 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 크라우처 재단과 시티 대학교 스타트업 기금의 기금으로 지원되었습니다. 우리는 실험과 원고의 비판적 독서에 도움을 차우 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
| 300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
| Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
| BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
| EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
| Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
| Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
| Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
| Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
| HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
| LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
| Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
| NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
| NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
| NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
| NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
| PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
| Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
| R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
| Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
| Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
| TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |
References
- Takaoka, A., et al. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).
- Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).
- Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).
- Clark, D. N., et al. Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms. Frontiers in Immunology. 4, 360 (2013).
- Bo, M., et al. Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens. Scientific Reports. 8 (1), 1789 (2018).
- Duffau, P., et al. Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model. Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).
- Feng, D., et al. Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching. European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).
- Richez, C., et al. IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).
- Tada, Y., et al. Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice. Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).
- Weiss, M., et al. IRF5 controls both acute and chronic inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).
- Schoenemeyer, A., et al. The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling. Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination. Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).
- Lopez-Pelaez, M., et al. Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).
- McGettrick, A. F., O’Neill, L. A. Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation. Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).
- Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity. Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).
- Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).
- Kawai, T., Akira, S. Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity. Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).
- Liu, Z., Davidson, A. Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances. Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).
- del Fresno, C., et al. Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans. Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).
- Wang, X., et al. Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia. Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).
- Zhao, Y., et al. Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5. Nature Communications. 10 (1), 1349 (2019).
- Almuttaqi, H., Udalova, I. A. Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation. FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).
- Chow, K. T., et al. Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells. The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).
- Cheng, T. F., et al. Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection. The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).
- Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation. PLoS One. 7 (3), 33098 (2012).
- Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).
- Stone, R. C., et al. Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons. Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).
- De, S., et al. B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation. Frontiers in Immunology. 8, 1938 (2017).
- Fabie, A., et al. IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection. Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).
- Cushing, L., et al. IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).
- Li, C., Arakawa, T. Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein. International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).
- Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104. Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).
- Reynolds, J. A., Tanford, C. Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios – Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002 (1970).
- Manning, M., Colon, W. Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. 생화학. 43 (35), 11248-11254 (2004).
- Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway. Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).
- Paun, A., et al. Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response. Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).
- Yasuda, K., et al. Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production. The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).
- Steinhagen, F., et al. IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells. European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).
- Gratz, N., et al. Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection. PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345 (2011).
