Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique
Summary
Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l’isolement du cartilage et de l’os des sections congelées fraîches de l’embryon de souris. Le cartilage et l’os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l’ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptomique.
Abstract
La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler des types de cellules ou des régions d’intérêt spécifiques des tissus hétérogènes. La complexité cellulaire et moléculaire des éléments squelettiques augmente avec le développement. L’hétérogénéité tissulaire, comme à l’interface des éléments cartilagineux et osseux les uns avec les autres ou avec les tissus environnants, est un obstacle à l’étude du développement du cartilage et des os. Notre protocole fournit une méthode rapide de traitement des tissus et l’isolement du cartilage et des os qui donne un ARN de haute qualité pour l’analyse de l’expression génique. Les tissus congelés frais des embryons de souris sont sectionnés et de brèves taches violettes cresyl est utilisée pour visualiser le cartilage et les os avec des couleurs distinctes des tissus environnants. Les glissements sont alors rapidement déshydratés, et le cartilage et l’os sont isolés par la suite par LCM. La minimisation de l’exposition aux solutions aqueuses au cours de ce processus maintient l’intégrité de l’ARN. Le cartilage et l’os mandibulaire de Mouse Meckel à E16.5 ont été avec succès rassemblés et l’analyse d’expression de gène a montré l’expression différentielle des gènes de marqueur pour des ostéoblastes, des osteocytes, des osteoclastes, et des chondrocytes. L’ARN de haute qualité a également été isolé à partir d’une gamme de tissus et d’âges embryonnaires. Ce protocole détaille la préparation de l’échantillon pour le LCM, y compris la cryoembedding, le sectionnement, la coloration et la déshydratation des tissus frais congelés, et l’isolement précis du cartilage et de l’os par LCM ayant pour résultat l’ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptomique.
Introduction
Le système musculo-squelettique est un système multicomposant composé de muscle, tissu conjonctif, tendon, ligament, cartilage et os, innervé par les nerfs et vascularisé par les vaisseaux sanguins1. Les tissus squelettiques se développent avec l’hétérogénéité cellulaire croissante et la complexité structurale. Le cartilage et l’os se développent à partir de la même lignée osteochondroprogenitor et sont fortement liés. Le cartilage et l’os embryonnaires se développent en association avec des muscles, des nerfs, des vaisseaux sanguins, et le mésenchyme indifférencié. Le cartilage peut également être entouré par l’os, tel que le cartilage de Meckel et le cartilage condylar dans l’os mandibulaire. Ces tissus sont anatomiquement associés et interagissent les uns avec les autres par des signaux extracellulaires au cours du développement. Dans l’étude de l’expression génique dans le développement du cartilage et de l’os, un obstacle est l’hétérogénéité des structures squelettiques composées de plusieurs types de tissus. L’isolement précis du tissu spécifique d’intérêt est la clé pour l’analyse transcriptionnelle réussie.
La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler les types de cellules ou les régions d’intérêt dans les tissus hétérogènes, et est reproductible et est sensible au niveau cellulaire unique2. Il peut précisément cibler et capturer des cellules d’intérêt pour un large éventail d’essais en aval dans la transcriptomique, la génomique et la protéomique3,4. La qualité de l’ARN, de l’ADN ou de la protéine isolés peut être évaluée à l’aide d’un bioanalyseur ou d’une plate-forme équivalente. Par exemple, la qualité de l’ARN est indiquée par le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN)5.
Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration rapide et l’isolement du cartilage et de l’os par LCM des tissus congelés frais. Nous utilisons l’embryon de souris pour démontrer que ce protocole donne de l’ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptomique ultérieure, comme le séquençage de l’ARN (ARN-seq).
Protocol
Representative Results
Discussion
LCM permet l’isolement des populations cellulaires enrichies ou homogènes des tissus hétérogènes. Ses avantages incluent la capture rapide et précise des cellules dans leur contexte in vivo, tandis que les inconvénients potentiels incluent qu’il est long, coûteux, et limité par la nécessité pour l’utilisateur de reconnaître les sous-populations distinctes dans un échantillon spécifié30. Ce protocole fournit des détails de LCM du cartilage embryonnaire de souris et de l’os, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) et l’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Les auteurs remercient le Biorepository and Pathology Core pour l’accès à la plate-forme Leica LMD 6500 à l’école de médecine Icahn à Mount Sinai.
Materials
| 2-Methylbutane | ThermoFisher Scientific | O3551-4 | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 339653 | Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL |
| Cresyl violet acetate | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Delicate task wiper | ThermoFisher Scientific | 06-666 | |
| Disposable embedding mold | ThermoFisher Scientific | 1220 | |
| Distilled water | Invitrogen | 10977-015 | DNase/RNase-Free |
| Ethanol, absolute (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818 | Molecular biology grade |
| Glass PEN membrane slide | Leica Microsystems | 11505158 | |
| LCM system | Leica Microsystems | Leica LMD6500 | |
| Microscope cover glass | ThermoFisher Scientific | 12-545FP | |
| Microscope slides | ThermoFisher Scientific | 12-550-15 | |
| OCT compound | Electron Microscopy Sciences | 102094-106 | |
| PCR tube with flat cap, 0.5 mL | Axygen | PCR-05-C | LCM collection tubes |
| Permanent mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| RNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | KIT0204 | |
| RNase decontamination agent | Sigma-Aldrich | R2020 | RNase decontamination agent for cleaning surfaces |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 |
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