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발생학

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60503
, , , ,
1Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

Abstract

레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이질적인 조직에서 특정 세포 모형 또는 관심 있는 지구를 격리하는 강력한 공구입니다. 골격 원소의 세포 및 분자 복잡성은 발달과 함께 증가합니다. 조직 이질성, 같은 서로 또는 주변 조직과 연골 및 골변 요소의 계면에서, 연골과 뼈를 개발하는 연구에 하나의 장애물이다. 당사의 프로토콜은 유전자 발현 분석을 위해 고품질 RNA를 산출하는 연골과 뼈의 조직 처리 및 격리의 신속한 방법을 제공합니다. 마우스 배아의 신선한 냉동 조직은 단면화되고 짧은 크레실 바이올렛 염색은 주변 조직과 구별되는 색상으로 연골과 뼈를 시각화하는 데 사용됩니다. 슬라이드는 다음 빠르게 탈수, 연골과 뼈는 LCM에 의해 이후에 격리. 이 프로세스 동안 수성 솔루션에 대한 노출을 최소화하면 RNA 무결성이 유지됩니다. 마우스 메켈의 연골과 E16.5에서 하악골이 성공적으로 수집되었고 유전자 발현 분석은 조골세포, 골세포, 골세포 및 연골세포에 대한 마커 유전자의 차등 발현을 보여주었다. 고품질 RNA는 또한 다양한 조직 및 배아 시대로부터 분리되었다. 이 프로토콜은 냉동, 절제, 염색 및 탈수를 포함한 LCM에 대한 샘플 준비를 자세히 설명하며, LCM에 의한 연골과 뼈의 정밀한 분리는 전사분석을 위한 고품질 RNA를 생성합니다.

Introduction

근골격계는 근육, 결합 조직, 힘줄, 인대, 연골 및 뼈로 구성된 다성분 시스템으로, 신경에 의해 심이도가 있고혈관에의해 혈관이 혈관에 의해 1. 골격 조직은 증가 세포 이질성 및 구조적 복잡성으로 개발. 연골과 뼈는 동일한 골연방울 감소기 계보에서 개발하고 매우 관련이 있습니다. 배아 연골과 뼈는 근육, 신경, 혈관 및 미분화 중간엽과 관련하여 발생합니다. 연골은 또한 뼈에 의해 포위 될 수있다, 이러한 Meckel의 연골과 하악골 내의 condylar 연골 등. 이 조직은 해부학적으로 연관되고 발달 도중 세포외 신호를 통해 서로 상호 작용합니다. 연골과 뼈의 발달에 있는 유전자 발현의 연구 결과에서, 1개의 장애물은 다중 조직 모형으로 구성된 골격 구조물의 이질성입니다. 관심 있는 특정 조직의 정밀한 분리는 성공적인 전사 분석을 위한 열쇠입니다.

레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이기종 조직 내의 세포 유형 또는 관심 영역을 분리하는 강력한 도구이며 재현 가능하며 단일 세포 수준2에민감합니다. 전사학, 유전체학 및 프로테오믹스3,4에서광범위한 하류 검소에 대한 관심 있는 세포를 정밀하게 표적화하고 포획할 수 있다. 단리된 RNA, DNA, 또는 단백질의 질은 바이오분석기 또는 동등한 플랫폼으로 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA 품질은 RNA 무결성 번호(RIN)5로표시됩니다.

여기에서, 우리는 신선한 냉동 조직에서 LCM에 의한 연골과 뼈의 신속한 염색 및 격리를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 배아를 사용하여 이 프로토콜이 RNA 시퀀싱(RNA-seq)과 같은 후속 전사분석을 위해 고품질 RNA를 산출한다는 것을 입증합니다.

Protocol

마우스에서 조직은 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회에 따라 장악되고, 연구 프로토콜은 마운트 시나이에 있는 Icahn 의과 대학에 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 신선한 냉동 표본의 준비 관심 있는 배아 또는 조직을 해부합니다. 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 일회용 임베딩 금형에 시료를 내장합니다. 팁이?…

Representative Results

E16.5에서 신선한 냉동 마우스 조직의 코로나 섹션은 Meckel의 연골 (MC), condylar 연골 및 LCM에 의한 하악골의 격리 및 수집을 입증하는 데 사용되었습니다. E16.5에서 마우스 배아는 OCT 화합물을 가진 극저온 형에 해부되고 매립되었다. 금형의 시료를 드라이 아이스 및 메틸-2-부탄 배스에서 급속히 동결시키고 -80°C에서 보관하였다. 연골과 뼈의 크레실 바이올렛 염색을 입증하기 위…

Discussion

LCM은 이질적인 조직에서 농축되거나 균질한 세포 집단의 분리를 가능하게 한다. 그 장점은 생체 내 컨텍스트에서 세포의 신속하고 정확한 캡처를 포함, 잠재적 인 단점은 시간이 소요되는 것을 포함, 비싼, 지정된 샘플 내에서 뚜렷한 하위 집단을 인식하는 사용자에 대한 필요성에 의해 제한30. 이 프로토콜은 마우스 배아 연골과 뼈의 LCM의 세부 사항을 제공, RNA-seq에 의해 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 치과 및 두개안면 연구의 국립 연구소 (R01DE022988)와 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (P01HD078233)에 의해 지원되었다. 저자는 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학에서 라이카 LMD 6500 플랫폼에 액세스 할 생물 rerepository 및 병리학 코어 감사합니다.

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736
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References

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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).
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