فصل مغلف الخلية للبكتيريا سالبة الجرام إلى كسور الغشاء الداخلي والخارجي مع التعديلات التقنية لـ Acinetobacter baumannii
Summary
تنتج البكتيريا السالبة للجرام غشاءين منفصلين مكانًا. يتم تقسيم الغشاء الخارجي من الغشاء الداخلي بواسطة periplasm وطبقة peptidoglycan. كانت القدرة على عزل الطبقات الثنائية من هذه الميكروبات حاسمة لفهم فسيولوجيا ها ومسببات الأمراض.
Abstract
تعمل هذه الطريقة عن طريق تقسيم مغلف البكتيريا السالبة للجرام إلى كسور غشاء إجمالي وداخلي وخارجي (OM) وتختتم بمقالات لتقييم نقاء الطبقات الثنائية. وOM لديها زيادة الكثافة الإجمالية بالمقارنة مع الغشاء الداخلي، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى وجود lipooligosaccharides (لوس) وlipopolysaccharides (LPS) داخل النشرة الخارجية. جزيئات لوس وLPS هي الدهون الغليكوليبيدات الأمبيباثية التي لها بنية مماثلة ، والتي تتكون من الدهون – A disaccharolipid والأساسية oligosaccharide substituent. ومع ذلك، يتم تزيين جزيئات LPS فقط مع وحدة فرعية ثالثة تعرف باسم O-polysaccharide، أو O-مستضد. سيؤثر نوع وكمية الدهون الغليكوبيدية الموجودة على كثافة OM للكائن الحي. لذلك ، اختبرنا ما إذا كانت أغشية البكتيريا ذات محتوى الغليكوبيد المتنوع يمكن عزلها بالمثل باستخدام تقنيتنا. بالنسبة للكائنات الحية المنتجة لـ LPS ، السالمونيلا enterica serovar Typhimurium وEscherichia coli، تم عزل الأغشية بسهولة ولم يؤثر MOS O-antigen على التقسيم الثنائي الطبقات. Acinetobacter baumannii تنتج جزيئات لوس, التي لديها كتلة مماثلة لجزيئات إل بي س المستضد ناقص O; ومع ذلك ، لا يمكن فصل أغشية هذه الميكروبات في البداية. لقد قمنا بمعلل أن OM of A. baumannii كانت أقل كثافة من تلك التي من Enterobacteriaceae ، لذلك تم تعديل تدرج السكروز وعزل الأغشية. وبالتالي يمكن تكييف هذه التقنية وتعديلها لاستخدامها مع الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
البكتيريا سالبة الغرام تنتج اثنين من الأغشية التي يتم فصلها عن طريق الفضاء periplasmic وجدار الخلية peptidoglycan1. الغشاء الداخلي (IM) يغلف السيتوسول وهو ثنائي طبقة متماثلة من الفوسفوليبيدات. Peptidoglycan يحمي ضد ضغط تورغور ويوفر البكتيريا مع شكل الخلية، وتعلق على الغشاء الخارجي (OM) عن طريق البروتينات الدهنية2،3. وOM تحيط periplasm وغير المتماثلة في الغالب. تتكون النشرة الداخلية من الفوسفوليبيدات وتتكون النشرة الخارجية من غليكوليبيدات تعرف باسم ليبوليغوساكيريديس (LOS) أو ليبوبوليكيساسيدس (LPS)4،5. عدم التماثل في الدهون والكيمياء الحيوية لجزيئات لوس / LPS في المنشور الخارجي يضفي خصائص الحاجز على سطح الخلية التي تحمي البكتيريا من المخاطر في بيئتها6,7.
تتكون جزيئات LPS من ثلاثة مكونات: الدهون A disaccharolipid ، وoligosaccharide الأساسية ، وO-polysaccharide أو O-مستضد. الدهون A هو disaccharolipid متضاعف. تتكون core-oligosaccharides من 10-15 السكريات المعروفة باسم LPS الخام أو R-LPS. وينقسم اللب إلى المنطقة الداخلية، ويتألف من 2-كيتو-3-ديوكسي-د-مانو-حمض الثمانية وثماني سونيك (kdo) واحد أو أكثر من بقايا heptose، والمنطقة الخارجية التي تتكون عموما من الهكسوس (الجلوكوز أو الجالاكتوز) وهيبتوس، أو السكريات الأسيتاميد5. المنطقة الأساسية الخارجية هي أكثر متغيرة في مكوناتها وبنيتها من النواة الداخلية. في السالمونيلا spp., وقد وصفت هيكل واحد فقط الأساسية; ومع ذلك، في الإشريكية القولونية هناك خمسة هياكل أساسية مختلفة (المعينة K-12، R1، R2، R3، و R4)8. E. القولونية K-12 DH5α، التي نستخدمها في هذا الإجراء يحمل طفرة أن يؤدي إلى إنتاج R-LPS9. جزيئات R-LPS تفتقر إلى moiety O-مستضد ولها وزن جزيئي مماثل لجزيئات لوس.
إضافة O-مستضد إلى R-LPS يحول هذا الجزيء إلى LPS على نحو سلس، أو S-LPS. تم بناء المستضدات O من الوحدات الفرعية الكربوهيدرات 3-4 قصيرة وتتكون من طرائق متعددة مع أطوال سلسلة متفاوتة10. بعض البكتيريا المنتجة LPS، مثل السالمونيلا enterica سيروفار تيفيموريوم(S. Typhimurium), عرض توزيع ثلاثي الوسائط من جزيئات LPS على سطحها10,11. سلسلة طويلة جدا O-المستضدات يمكن أن تحتوي على أكثر من مائة وحدة فرعية وتزن أكثر من مائة كيلودالتون. توفر المستضدات O خصائص سطحية للبكتيريا الضرورية لمقاومة المضادات الحيوية ، والتهرب من الافتراس عن طريق البكتيريا ، وتسبب المرض.
أنواع كامبيلوباكتر، بوردتيلا، Acinetobacter، Haemophilus، النسيرية وغيرها تولد جزيئات لوس بدلا من جزيئات LPS على سطحها12. تتكون جزيئات LOS من الدهون A وoligosaccharides الأساسية ولكنها تفتقر إلى المستضد O. هذه الأنواع من البكتيريا السلبية غرام تعديل oligosaccharides الأساسية مع السكريات إضافية وتركيبات من السكريات لتغيير خصائص السطح12. كل من الميكروبات التي تنتجها لوس وLPS اشتقاق الفوسفات على الدهون A والجزيئات الأساسية مع moieties cationic7. وتشمل هذه الإضافات فوسفوإيثانولامين، والجالاكتوزامين وبدائل الأنف الأميني، والتي تعمل عن طريق تحييد الشحنة السطحية الأنيونية وبالتالي الحماية من الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية. البكتيريا سالبة الجرام أيضا تعديل بنية أوليغوساكاريد الأساسية مع بدائل متغيرة غير stoichiometric من السكريات، أو جزيئات إضافية الكدو، وتغيير عدد سلاسل أسيل على الدهون-A disaccharolipids7.
القدرة على عزل الدردشة من OM من البكتيريا السلبية غرام كان مفيدا لفهم دور مغلف الخلية في مقاومة مضادات الميكروبات ومرض المرض11,12. وقد استخدمت اشتقاقات هذا النهج لاستخلاص آليات التجميع والصيانة وإعادة عرض مكونات البروتين والفوسفوليبيد والغليكبيدين لـ OM.
يقوم مختبرنا بشكل روتيني بإجراء تحليلات الدهون البكتيرية لدراسة تنظيم الدهون بوساطة البروتين ووظيفة الدهون في مجموعة متنوعة من الأنواع السلبية للجرام. تعكس الأحجام المستخدمة في البروتوكول الاستخدام الروتيني لهذا الإجراء لتحليل الفوسفوليبيدات غير الملصقة بالراديو بواسطة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة وكروماتوغرافيا سائلة جنباإلى جنب الطيف الكتلي13،14.
يبدأ البروتوكول بتعريض تعليق مبرد للبكتيريا سالبة الجرام إلى محلول سكروز عالي السكروز وإضافة الليسوزيمي لفصل OM عن طبقة peptidoglycan الأساسية(الشكل 1)12. ثم يتم إضافة EDTA لتسهيل اختراق الليسوزيم ، لأن عزل التقاض المقسوم يعطل تفاعلات التجسير الكهروستاتيكي ة الجانبية بين جزيئات LOS / LPS المجاورة15. البروتوكول الأصلي الذي تم تكييفلنا يتطلب تشكيل spheroplasts، شكل الخلية البكتيرية السلبية غرام التي تتكون من غشاء البلازما والسيتوسول، ولكن يفتقر إلى طبقة peptidoglycan وOM. فمن الممكن أن يتم إنتاج spheroplasts عن طريق طريقة تكييفها; ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لا تعتمد أو تنوي تشكيلها للنجاح. بدلا من ذلك ، يتم حصاد البكتيريا المعالجة lysozyme-EDTA بسرعة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في محلول السكروز من تركيز أقل قبل الانحلال المضغوط. وينبغي نظرياً أن تكون الآليات اللوائية التي قد تكون قد أُفرج عنها عن طريق تشكيل السُبل الكروية قابلة للحصاد من الخلايا الخارقة، ولكن هذا النهج غير مفصل هنا. في نهاية المطاف ، تخضع الخلايا المعالجة للتجانس التقليدي وتحلال الدم ، مما يعزز كفاءة وتكرار إجراء فصل الغشاء16.
بعد الانزل ، يتم جمع الأغشية الإجمالية عن طريق ultracentrifugation وتطبيقها على تدرج كثافة السكروز متقطع ة لكسور IMs و OMs. النهج الكلاسيكي يستخدم التدرج أكثر مستمرة التي تتكون من ما لا يقل عن خمسة حلول السكروز مختلفة11،12. التدرج المتقطع في بروتوكولنا يتكون من ثلاثة حلول السكروز ويقسم الطبقات الثنائية إلى كسرين متميزين17. جزيئات لوس وLPS داخل OMs من البكتيريا سالبة الغرام محرك المغلف لتقسيم إلى أعلى البني منخفضة الكثافة IM جزء وأسفل أبيض عالي الكثافة OM كسر(الشكل 1 والشكل 2).
Acinetobacter baumannii هي أهم مسببات الأمراض البشرية المقاومة للأدوية التي تنتج جزيئات LOS في OM الخاصة بهم وإقامة مغلف الخلية التي يصعب فصل18،19. يشير العمل الأخير إلى أن اشتقاق البروتوكول الذي نقدمه هنا يمكن استخدامه لتقسيم الطبقات الثنائية لهذه الكائنات20. لذلك، اختبرنا بروتوكولنا على A. baumannii 17978. في البداية، كان الإجراء غير كاف. ومع ذلك، قمنا بتعديل تركيز السكروز من محلول الكثافة الوسطى وتحسنت كثيرا فصل(الشكل 2). تم استخدام فحص NADH dehydrogenase وإجراءات استخراج كشف LOS/LPS لتأكيد الانفصال عن A. baumannii، من النوع البري S. التيفيموريوم واثنين من O-مستضد نقص الأنماط الجينية البكتيرية; وهي، galE-متحولة S. التيفيموريوم وسلالة مختبرية، E. coli DH5α(الشكل 3 والشكل 4).
الغرض من هذا العمل هو توفير نهج مبسط لعزل أغشية البكتيريا السلبية الجرامية بشكل مستنسخ. يمكن استخدام البروتوكول لدراسة العديد من أنواع الجزيئات المرتبطة بالأغشية لهذه الميكروبات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة سوف تستمر في مساعدة الباحثين في فهم دور مغلف الخلية في علم وظائف الأعضاء البكتيرية ومسببات الأمراض. بعد خطوات ultrarifugation متتابعة يمكن الحصول على مجموع منقى، الداخلية، وOM كسر. يمكن أن تكون هذه الأغشية في عزلة لاختبار الفرضيات المتعلقة بتوطين بروتين الأغشية ووظيفتها ، والنقل والا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل P20GM10344 و R01AI139248 الممنوحة لZ. D. Dalebroux.
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
- Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
- Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
- Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
- Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
- Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
- Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
- Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
- Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
- Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
- Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
- Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
- Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
- Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
- Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
- Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
- Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
