아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리
Summary
그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.
Abstract
이 방법은 그람 음성 박테리아의 봉투를 총, 내부 및 외부 멤브레인 (OM) 분획으로 분할하여 작동하고 이중 층의 순도를 평가하기 위해 분석으로 결론을 내립니다. OM은 외부 리플렛 내 리풀리고당(LOS) 및 리포폴리당류(LPS)의 존재로 인해 내부 멤브레인에 비해 전체 밀도가 증가합니다. LOS 및 LPS 분자는 지질-A 디사카롤리피드 및 코어-올리고당 치환제으로 구성된 유사한 구조를 가지는 양과병성 글리콜리피피이다. 그러나, 오직 LPS 분자만이 O-다당류 또는 O 항원으로 알려진 제3 소단위로 장식된다. 존재하는 글리콜리파이드의 종류와 양은 유기체의 OM 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 우리는 다양한 글리콜리파이드 함량을 가진 박테리아의 막이 우리의 기술을 사용하여 유사하게 분리될 수 있는지 시험했습니다. LPS 생산 유기체의 경우, 살모넬라 테네리카 혈청염 혈청염 및 대장균,막을 쉽게 분리하고 LPS O-항원 모이어티는 이중층 분할에 영향을 미치지 않았다. 아신토박터 바우마니는 LOS 분자를 생산, 이는 O 항원 결핍 LPS 분자와 유사한 질량을 갖는다; 그러나, 이 세균의 막은 처음에 분리될 수 없었습니다. 우리는 A. baumannii의 OM이 장내 세균과보다 밀도가 낮기 때문에 자당 그라데이션을 조정하고 막을 분리했다고 추론했습니다. 따라서 이 기술은 다른 유기체와 함께 사용하기 위해 조정 및 수정될 수 있습니다.
Introduction
그람 음성 박테리아는 주변 공간과 펩티도글리칸 세포벽1에의해 분리되는 2개의 막을 일으킵니다. 내부 막 (IM) 사이토솔을 감싸고 인지질의 대칭 이중층이다. 펩티도글리칸은 터고 압력으로부터 보호하고 세포 형상을 가진 박테리아를 제공하며, 지단백질2,,3에의해 외부 막(OM)에 부착된다. OM은 주변을 둘러싸고 있으며 주로 비대칭입니다. 내부 리플렛은 인지질로 구성되며 외부 리플리피드(LOS) 또는 리포폴리당당(LPS)4,,5로구성된다. 외부 리플렛에서 LOS/LPS 분자의 지질 비대칭 및 생화학은 그 환경의 위험으로부터 박테리아를 보호하는 세포 표면에 장벽특성을부여한다6,7.
LPS 분자는 3개의 성분으로 구성됩니다: 지질 A 이시카롤리피드, 코어 올리고당, 및 O-다당류 또는 O 항원. 지질 A는 곱한 비실화 된 디실로리피드입니다. 코어 올리고당은 거친 LPS 또는 R-LPS로 알려진 10-15 개의 설탕으로 구성됩니다. 코어는 2-케토-3-데옥시-D-만노 옥투로소닉산(kdo) 및 하나 이상의 헵토스 잔류물, 그리고 일반적으로 육각(포도당 또는 갈락토제) 및 헥토스, 또는 아세타미도 당분5로구성된 외부 영역으로 구성된 내부 영역으로 세분화된다. 외부 코어 영역은 내부 코어보다 구성 요소 및 구조에서 더 가변적입니다. 살모넬라 spp.,오직 하나의 코어 구조만 기술되었다; 그러나, 대장균에는 다섯 가지 핵심 구조 (K-12, R1, R2, R3 및 R4)가8있습니다. 이 절차에서 사용하는 대장균 K-12 DH5α는 생산 R-LPS9의결과를 초래하는 돌연변이를 전달합니다. R-LPS 분자는 O 항원 moiety 부족 하 고 LOS 분자와 비슷한 분자량을 가지고.
R-LPS에 O 항원추가는 이 분자를 매끄러운 LPS, 또는 S-LPS로 바꿉니다. O 항원 짧은 3-4 탄수화물 하위 단위에서 구축 하 고 다양 한 체인 길이 여러 양식으로 구성10. 살모넬라 테네리카 혈로바르 티피무리움(S.S 티피무리움) 표면10,,11에LPS 분자의 트리모달 분포를 표시한다. 매우 긴 사슬 O 항원은 100개 이상의 하위 유닛을 포함하고 100킬로달톤 이상의 무게를 견딜 수 있습니다. O 항원 항생제저항, 박테리오파지에 의한 포식 회피, 질병 유발에 필요한 박테리아에 표면 특성을 제공합니다.
캄필로박터, 보르데텔라, 아시네토박터, 헤모필루스, 네이세리아 등의 종은 표면에서 LPS 분자 대신 LOS 분자를 생성한다12. LOS 분자는 지질 A및 코어 올리고당으로 이루어져 있지만 O 항원이 부족하다. 이러한 유형의 그람 음성 박테리아는 표면 특성을 변경하기 위해 추가의 설탕 및 당조합으로 그들의 핵심 올리고당을수정한다 12. LOS 및 LPS 생산 미생물 모두 지질 A에 인산염을 생성하고 양이온성 모아티7을가진 코어 분자. 이러한 추가는 항이온성 표면 전하를 중화하고 양이온 항균 펩티드로부터 보호함으로써 기능하는 인산화탄올아민, 갈락토사민 및 아미노아라비노스 치환을 포함한다. 그람 음성 박테리아는 또한 당분, 또는 여분의 kdo 분자의 가변 비-stoichiometric 치환으로 코어 올리고당 구조를 수정하고, 지질-A 디사카롤리피드에 아실 사슬의 수를변경7.
그람 음성 박테리아의 OM으로부터 IM을 분리하는 능력은 항균성 내성 및 질병 병인에서 세포 봉투의 역할을 이해하는 데 중요한 역할을 하고있다11,,12. 이 접근법의 유도체는 OM에 대한 단백질, 인지질 및 글리콜리파이드 성분의 조립, 유지 보수 및 리모델링의 메커니즘을 추론하는 데 사용되어 왔다.
저희 실험실은 정기적으로 세균성 지질 분석을 수행하여 다양한 그람 음성 종에서 단백질 매개 지질 조절 및 지질 기능을 연구합니다. 프로토콜에 사용되는 부피는 얇은 층 크로마토그래피 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법에 의해 비 방사성 표지 된 인지질을 분석하기 위해이 절차의 일상적인 사용을반영13,,14.
프로토콜은 그람 음성 박테리아의 차가운 현탁액을 자당의 높은 삼투압 용액에 노출시키고 기본 펩티도글리칸 층으로부터 OM을 해리시키기 위해 리소자임(lysozyme)을 첨가함으로써 시작된다(도1)12. EDTA는 리소자이메의 침투를 용이하게 하기 위해 첨가되는데, 이는 인접한 LOS/LPS분자(15)사이의 측면 정전기 브리징 상호작용을 방해하기 때문에 양이온 격리가 중단되기 때문에. 우리의 적응 된 원래 프로토콜은 구형의 형성을 필요로, 플라즈마 막과 시토솔로 구성된 그람 음성 세균 세포 형태, 하지만 펩티도글리칸 층과 OM부족. 구형 세포가 적응 된 방법에 의해 생성 될 수 있습니다. 그러나, 기술은 성공을 위해 그들의 형성에 의존하거나 의도하지 않습니다. 대신, 리소자임-EDTA 처리 된 박테리아는 원심 분리에 의해 빠르게 수확되고 가압 용해 전에 낮은 농도의 자당 용액에서 다시 중단됩니다. 구형 세포를 형성하여 방출되었을 수 있는 OM은 이론적으로 처리된 세포의 상황체로부터 수확할 수 있어야 하지만, 이 접근법은 여기에 상세히 설명되어 있지 않다. 궁극적으로, 처리된 세포는 종래의 균질화 및 용해를 행하며, 이는 막 분리절차(16)의효율 및 재현성을 향상시킨다.
용해 후, 총 멤브레인은 초원심분리에 의해 수집되고 EM 및 OM을 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 구배를 적용합니다. 고전적인 접근법은 적어도 5개의 상이한 자당 용액11,,12로구성된 보다 연속적인 그라데이션을 사용한다. 우리의 프로토콜의 불연속 그라데이션은 세 가지 자당 솔루션으로 구성되며 이중 층을 두 개의 별개의 분획17로분할합니다. 그람 음성 박테리아의 OM 내의 LOS 및 LPS 분자는 봉투를 상부 갈색 저밀도 IM 분획 및 하부 백색 고밀도 OM 분획으로 분할하도록 유도한다(도1 및 도 2).
아신토박터 바우만니는 그들의 OM에서 LOS 분자를 생성하고,18,19를분리하기 어려운 세포 봉투를 세우는 중요한 다제 내성 인간 병원체이다. 최근 연구는 우리가 여기에 존재하는 프로토콜의 유도가 이러한 유기체(20)의이중 층을 분할하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 따라서 A. baumannii 17978에서 프로토콜을 테스트했습니다. 처음에는 절차가 부적절했습니다. 그러나, 중간 밀도 용액의 자당 농도를 수정하고 분리를 크게 개선하였다(도2). NADH 탈수소 효소 분석 및 LOS/LPS 추출 및 검출 절차는 A. baumannii,야생형 S에 대한 분리를 확인하기 위해 사용되었다. 티피무륨 및 2개의 O-항원 결핍 장균 유전자형; 즉, galE-돌연변이 S. 티피무륨 및 실험실 균주, 대장균 DH5α(도3 및 도 4).
이 작업의 의도는 그람 음성 박테리아의 막을 재현 하 게 격리에 대 한 간소화 된 접근 방식을 제공 하는. 프로토콜은 이 세균을 위한 막 관련분자의 많은 모형을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 세균성 생리학 및 병인에 있는 세포 봉투의 역할을 이해에 있는 연구원을 돕기 위하여 계속할 것입니다. 순차적 초원심분리 단계에 이어 정제된 총, 내부 및 OM 분획을 얻을 수 있다. 이러한 멤브레인은 세포 단백질 국소화 및 기능, 주변을 가로지르는 수송 및 인신매매, 다양한 환경 조건 하에서 개별 이중층의 조성과 관련된 가설을 시험하기 위해 단독으로 분석될 수 있다. LOS/LPS 및 OM ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 P20GM10344 및 R01AI139248에 의해 Z. D. Dalebroux에 수여되었다.
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
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