Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar
Summary
Gram-negatif bakteriler iki mekansal olarak ayrılmış membran üretirler. Dış zar bir periplazm ve peptidoglikan tabakası ile iç zardan bölümlenir. Bu mikropların çift iki katmanlı izole yeteneği fizyolojisi ve patogenezini anlamak için kritik olmuştur.
Abstract
Bu yöntem, Gram-negatif bakterilerin zarfını total, iç ve dış membran (OM) fraksiyonlarına bölme ile çalışır ve iki katmanlı saflığı değerlendirmek için tahlillerle sonuçlandırır. OM iç membran ile karşılaştırıldığında artan bir genel yoğunluğu vardır, büyük ölçüde lipooligosaccharides varlığı nedeniyle (LOS) ve lipopolisakkaritler (LPS) dış broşür içinde. LOS ve LPS molekülleri benzer bir yapıya sahip amphipatif glikolipidler, bir lipid-A disakkarolipid ve çekirdek-oligosakkarit ikame oluşur. Ancak, sadece LPS molekülleri O-polisakkarit veya O-antijen olarak bilinen üçüncü bir alt birim ile dekore edilmiştir. Mevcut glikolipidlerin türü ve miktarı bir organizmanın OM yoğunluğunu etkileyecektir. Bu nedenle, çeşitli glikolipid içeriğine sahip bakterilerin zarlarının da tekniğimizle benzer şekilde izole edilip edilmeyeceğini test ettik. LPS üreten organizmalar için, Salmonella enterica serovar Typhimurium ve Escherichia coli, membranlar kolayca izole edildi ve LPS O-antijen moiety iki katmanlı bölümleme etkilemedi. Acinetobacter baumannii, O-antijen eksikliği LPS moleküllerine benzer kütleye sahip LOS molekülleri üretir; ancak, bu mikropların membranlar başlangıçta ayrılmış olamazdı. A. baumannii om’unun Enterobacteriaceae’den daha az yoğun olduğunu, bu nedenle sakaroz gradyanının ayarlandığını ve membranların izole edildiğini gerekçe gösterdik. Bu nedenle teknik uyarlanabilir ve diğer organizmalarile kullanılmak üzere değiştirilebilir.
Introduction
Gram-negatif bakteriler periplazmik alan ve peptidoglikan hücre duvarı1ile ayrılan iki membran üretirler. İç membran (IM) sitosol kapsar ve fosfolipidlerin simetrik bir çift katmanlı olduğunu. Peptidoglycan turgor basıncına karşı korur ve bir hücre şekli ile bakteri sağlar, ve dış membranbağlı (OM) lipoproteinler tarafından2,3. OM periplazmayı çevreler ve ağırlıklı olarak asimetriktir. İç broşür fosfolipidler oluşur ve dış broşür lipooligosaccharides olarak bilinen glikolipidler oluşur (LOS) veya lipopolysaccharides (LPS)4,5. Dış broşürdeki LOS/LPS moleküllerinin lipid asimetrisi ve biyokimyası, bakteriyi kendi ortamındaki tehlikelere karşı koruyan hücre yüzeyine bariyer özellikleri verir6,7.
LPS molekülleri üç bileşenden oluşur: lipid A disakkarolipid, çekirdek oligosakkarit, ve O-polisakkarit veya O-antijen. Lipid A, çoğalan bir asilate disakkarolipidtir. Core-oligosakkaritler kaba LPS veya R-LPS olarak bilinen 10-15 şekerden oluşur. Çekirdek iç bölgeye ayrılmıştır, oluşan 2-keto-3-deoksi-D-manno-octulosonic asit (kdo) ve bir veya daha fazla heptozkoz kalıntısı, ve genellikle heksoslar oluşan bir dış bölge (glikoz veya galaktoz) ve heptozlar, veya asetama şekerler5. Dış çekirdek bölgesi bileşenleri ve yapısında iç çekirdekten daha değişkendir. Salmonella spp., sadece bir çekirdek yapısı açıklanmıştır; ancak, Escherichia coli beş farklı çekirdek yapıları (K-12, R1, R2, R3 ve R4)8belirlenmiştir. Bu işlemde kullandığımız E. coli K-12 DH5α, r-LPS9üretimine neden olan bir mutasyon taşır. R-LPS molekülleri O-antijen moiety eksikliği ve LOS molekülleri benzer bir molekül ağırlığına sahip.
R-LPS’ye O-antijen eklenmesi bu molekülü yumuşak LPS veya S-LPS’ye dönüştürür. O-antijenler kısa 3-4 karbonhidrat alt birimlerinden üretilmiştir ve10zincir uzunlukları değişen birden fazla yöntem oluşur. Bazı LPS üreten bakteriler, Salmonella enterica serovar Typhimurium gibi (S. Typhimurium), kendi yüzeyinde LPS moleküllerinin trimodal dağılımını görüntülemek10,11. Çok uzun zincir O-antijenler yüz alt birim içerebilir ve yüz kilodalton üzerinde ağırlığında. O-antijenler antibiyotiklere direnmek, bakteriyofajlar tarafından predation kaçınmak için gerekli olan bakteri yüzey özellikleri sağlar, ve hastalığa neden.
Campylobactertürleri , Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria ve diğerleri kendi yüzeyinde LPS molekülleri yerine LOS molekülleri oluşturmak12. LOS molekülleri lipid A ve çekirdek oligosakkaritler oluşur ama O-antijen eksikliği. Gram-negatif bakterilerin Bu tür yüzey özellikleri12değiştirmek için ek şeker ler ve şeker kombinasyonları ile çekirdek oligosakkaritler değiştirmek. Hem LOS hem de LPS üreten mikroplar lipid A ve katyonik moieties7ile çekirdek molekülleri fosfatlar türemiş . Bu eklemeler fosfoetanolamin içerir, galaktosamin ve aminoarabinose ikameler, anyonik yüzey yükü nötralize ederek işlev ve bu nedenle katyonik antimikrobiyal peptidler karşı koruma. Gram-negatif bakteriler de şekerdeğişken olmayan stoiyometrik ikame ile çekirdek oligosakkarit yapısını değiştirmek, ya da ekstra kdo molekülleri, ve lipid-A disaccharolipidler üzerinde asil zincirlerin sayısını değiştirmek7.
Yeteneği Gram-negatif bakterilerin OM im izole etmek için antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hücre zarfının rolünü anlamak için etkili olmuştur11,12. Bu yaklaşımın türevleri, OM için protein, fosfolipid ve glikolipid bileşenlerinin montaj, bakım ve yeniden biçimlendirilmesi mekanizmalarını saptamak için kullanılmıştır.
Laboratuvarımız, çeşitli Gram-negatif türlerde protein aracılı lipid regülasyonu ve lipid fonksiyonunu incelemek için rutin olarak bakteriyel lipidomik analizler yapar. Protokolde kullanılan hacimler ince tabaka kromatografisi ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi13,14ile radyoetiketli olmayan fosfolipidleri analiz etmek için bu işlemin rutin kullanımını yansıtır.
Protokol, Gram-negatif bakterilerin soğutulmuş süspansiyonunun yüksek ozroz çözeltisine maruz kalmaları ve OM’yi altta yatan peptidoglikan tabakasından ayrıştırmak için lisozyme ekleyerek başlar (Şekil 1)12. EDTA daha sonra lizozim penetrasyon kolaylaştırmak için eklenir, divalent katyon sekestrasyon komşu LOS / LPS molekülleri arasındaki lateral elektrostatik köprü etkileşimleri bozar beri15. Bizimkinin uyarlandığı orijinal protokol, plazma zarı ve sitosoldan oluşan gram-negatif bakteri hücresi formu olan sferoplastların oluşumunu gerektiriyordu, ancak peptidoglikan tabakası ve OM’den yoksun. Spheroplastların uyarlanmış yöntemle üretilmeleri mümkündür; ancak, teknik, başarı için kendi oluşumuna güvenmez veya niyet etmez. Bunun yerine, lysozyme-EDTA tedavi edilen bakteriler santrifüj ile hızla hasat edilir ve basınçlı lysis önce daha az konsantrasyon bir sakaroz çözeltisi yeniden askıya alınır. Spheroplastlar oluşturarak serbest bırakılmış olabilecek OM’ler teorik olarak tedavi edilen hücrelerin süpernatants hasat edilmelidir, ancak bu yaklaşım burada ayrıntılı değildir. Sonuçta, tedavi hücreleri membran ayırma prosedürü16verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırır konvansiyonel homojenizasyon ve lysis, tabi tutulur.
Lysis’ten sonra, toplam membranlar ultrasantrifüj ile toplanır ve IM’ler ve OM’leri fraksiyonetmek için sürekli sakaroz yoğunluğu gradyan uygulamasına uygulanır. Klasik yaklaşım en az beş farklı sakaroz çözeltisi11,,12oluşur daha sürekli bir degrade kullanır. Protokolümüzdeki kesintili degrade üç sakaroz çözeltisi oluşur ve iki kat iki farklı kesirler17bölümlür. Gram-negatif bakterilerin OM’leri içindeki LOS ve LPS molekülleri zarfı üst kahverengi düşük yoğunluklu BIR IM fraksiyonuna ve daha düşük beyaz yüksek yoğunluklu OM fraksiyonuna bölmeye iter(Şekil 1 ve Şekil 2).
Acinetobacter baumannii kendi OM LOS molekülleri üretmek ve ayırmak zor bir hücre zarfı dik önemli multidrug dirençli insan patojenler vardır18,19. Son çalışmalar, burada sunduğumuz protokolün bir türemiş bu organizmaların iki katmanlı20bölünmesi için kullanılabilir düşündürmektedir. Bu nedenle protokolümüzü A. baumannii 17978’de test ettik. Başlangıçta, prosedür yetersizdi. Ancak orta yoğunluk çözeltisinin sakaroz konsantrasyonu ve büyük ölçüde geliştirilmiş ayırma(Şekil 2)olarak değiştirildi. A. baumannii,yabani tip S. için ayrışmayı doğrulamak için NADH dehidrogenaz tayini ve LOS/LPS ekstraksiyon ve algılama prosedürü kullanılmıştır. Tiphimurium ve iki O-antijen eksikliği enterobakteriyel genotip; yani, galE-mutant S. Tiphimurium ve laboratuvar suşu, E. coli DH5α (Şekil 3 ve Şekil 4).
Bu çalışmanın amacı, Gram-negatif bakterilerin zarlarını tekrarlı bir şekilde izole etmek için düzenli bir yaklaşım sağlamaktır. Protokol bu mikroplar için membran ilişkili moleküllerin birçok türde çalışma için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, bakteri fizyolojisi ve patogenezinde hücre zarfının rolünü anlamada araştırmacılara yardımcı olmaya devam edecektir. Sıralı ultracentrifugation adımları aşağıdaki saflaştırılmış toplam, iç ve OM fraksiyonu elde edilebilir. Bu membranlar, membran protein lokalizasyonu ve fonksiyonu, periplazma boyunca taşınması ve ticareti ve çeşitli çevre koşullarında bireysel iki katmanlı bileşimi ile ilgili hipotezleri test etmek için izole olarak test edilebilir. Los/ LPS ve OM proteinleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma P20GM10344 ve R01AI139248 tarafından Z. D. Dalebroux’a verildi.
Materials
| 1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene | VWR | 525-0466 | |
| 1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap | VWR | 10416-312 | |
| 2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth | VWR | 10545-844 | |
| 4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well | BIORAD | 4561095 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer 10 mL | BIORAD | 1610747 | |
| 50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89049-174 | |
| 7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles | VWR | 71000-518 | |
| 70 mL polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355622 | |
| Agar Powder | VWR | A10752 | |
| B10P Benchtop pH Meter with pH Probe | VWR | 89231-664 | |
| Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF – TOC (bench version) | ThermoFisher Scientific | 50136146 | |
| Benzonase Nuclease | MilliporeSigma | 70746-3 | |
| EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | 4040-01 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin, Inc. | ||
| Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor | ThermoFisher Scientific | 75006526 | |
| Hydrochloric acid 6.0 N | VWR | BDH7204 | |
| IBI Scientific Orbital Platform Shaker | Fischer Scientific | 15-453-211 | |
| LB Broth Miller | VWR | 214906 | |
| Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade | VWR | VWRV0063 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| NADH | Sigma Aldrich | 10107735001 | |
| Optima XPN-80 – IVD | Beckman Coulter Life Sciences | A99839 | |
| Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS | Fischer Scientific | NC1624582 | |
| Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology | Sigma – Millipore | P4557 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | Thermofisher | 23238 | |
| Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit | Thermofisher | P20495 | |
| Proteacease -50, EDTA free | G Biosciences | 786-334 | |
| Proteinase K, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium hydroxide ≥99.99% | VWR | AA45780-22 | |
| Sorval RC 6 Plus Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 36-101-0816 | |
| Sucrose | MilliporeSigma | SX1075-3 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker | VWR | JT4109-6 | |
| Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 339160 | |
| Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm | Beckman Coulter Life Sciences | 344059 | |
| Vortex-Genie 2 | VWR | 102091-234 |
References
- Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
- Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
- Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
- Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
- Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
- Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
- Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
- Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
- Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
- Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
- Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
- Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
- Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
- Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
- Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
- Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
- Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
- Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
- Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).
