Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform
Summary
Dit protocol past celcyclusmetingen aan voor gebruik in een massacytometrieplatform. Met de multiparametermogelijkheden van massacytometrie maakt directe meting van jodiumopname identificatie van cellen in S-fase mogelijk, terwijl intracellulaire cyclusmarkers karakterisering van elke celcyclustoestand in een reeks experimentele omstandigheden mogelijk maken.
Abstract
De regulatie van de celcyclusfase is een belangrijk aspect van cellulaire proliferatie en homeostase. Verstoring van de regulerende mechanismen die de celcyclus regelen, is een kenmerk van een aantal ziekten, waaronder kanker. Studie van de celcyclus vereist het vermogen om het aantal cellen in elk deel van de celcyclusprogressie te definiëren en om duidelijk af te bakenen tussen elke celcyclusfase. De komst van massacytometrie (MCM) biedt een enorm potentieel voor single cell-analyse met hoge doorvoer door directe metingen van elementaire isotopen, en de ontwikkeling van een methode om de celcyclustoestand door MCM te meten, breidt het nut van MCM verder uit. Hier beschrijven we een methode die direct 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) meet, vergelijkbaar met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU), in een MCM-systeem. Het gebruik van deze op IdU gebaseerde MCM biedt verschillende voordelen. Ten eerste wordt IdU snel opgenomen in DNA tijdens de synthese, waardoor betrouwbare metingen van cellen in de S-fase mogelijk zijn met incubaties zo kort als 10-15 minuten. Ten tweede wordt IdU gemeten zonder de noodzaak van secundaire antilichamen of de noodzaak van DNA-afbraak. Ten derde kan IdU-kleuring gemakkelijk worden gecombineerd met meting van cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3), dat gezamenlijk een duidelijke afbakening van de vijf celcyclusfasen biedt. De combinatie van deze celcyclusmarkers met het grote aantal parameters dat mogelijk is met MCM maakt combinatie met tal van andere statistieken mogelijk.
Introduction
Massacytometrie maakt detectie van ongeveer 40 parameters mogelijk door gebruik te maken van de hoge resolutie en kwantitatieve aard van massaspectroscopie. Metaalgelabelde antilichamen worden gebruikt in plaats van fluorofoor geconjugeerde antilichamen die een groter aantal kanalen mogelijk maken en minimale spillover produceren 1,2. MCM heeft voor- en nadelen met betrekking tot celcyclusanalyse in vergelijking met flowcytometrie. Een groot voordeel van MCM is dat het grote aantal parameters de gelijktijdige meting van de celcyclustoestand mogelijk maakt over een groot aantal immunofenotypisch verschillende T-celtypen in zeer heterogene monsters. MCM is met succes gebruikt om de celcyclustoestand te meten tijdens normale hematopoëse in humaan beenmerg3 en transgene muizenmodellen van telomerasedeficiëntie4. Analyse van de celcyclustoestand bij acute myeloïde leukemie (AML) toonde aan dat de celcyclus correleerde met bekende reacties op klinische therapieën, wat een in vivo inzicht gaf in functionele kenmerken die therapieselecties kunnen informeren5. Een tweede voordeel van massacytometrische celcyclusanalyse is de mogelijkheid om een groot aantal andere functionele markers te meten die kunnen worden gecorreleerd met de celcyclustoestand. Recent werk is in staat geweest om eiwit- en RNA-synthese te correleren met de celcyclustoestand door het gebruik van IdU en metaalgelabelde antilichamen tegen BRU en rRNA6. Dit soort zeer parametrische analyse die de celcyclustoestand meet over talrijke populaties in een continuüm van differentiatie zou bijna onmogelijk zijn met de huidige flowcytometrietechnologie. Het grote nadeel van MCM is het ontbreken van vergelijkbare DNA- of RNA-vlekken als die worden gebruikt in fluorescerende flowcytometrie (bijv. DAPI, Hoechst, Pyronine Y, enz.). Fluorescerende kleurstoffen kunnen relatief nauwkeurige metingen van DNA- en RNA-gehalte geven, maar deze precisie is alleen mogelijk vanwege de veranderingen in de fluorescerende eigenschappen van deze kleurstoffen die optreden bij intercalatie tussen nucleotidebasen. MCM-analyse is dus niet in staat om DNA- of RNA-inhoud met vergelijkbare precisie te meten. In plaats daarvan is massacytometrische celcyclusanalyse gebaseerd op metingen van eiwitten die verband houden met de celcyclustoestand, zoals cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3) in combinatie met directe meting van het jodiumatoom van IdU-opname in S-fasecellen. Deze twee meetbenaderingen leveren zeer vergelijkbare resultaten op tijdens normale cellulaire proliferatie, maar kunnen mogelijk dissonant zijn wanneer de progressie van de celcyclus wordt verstoord.
Meting van het aantal cellen in elke celcyclusfase is belangrijk voor het begrijpen van de normale ontwikkeling van de celcyclus en de verstoring van de celcyclus, die vaak wordt waargenomen bij kankers en immunologische ziekten. MCM biedt betrouwbare meting van extracellulaire en intracellulaire factoren met behulp van metaalgelabelde antilichamen; de meting van de S-fase was echter beperkt omdat de op iridium gebaseerde DNA-intercalator geen onderscheid kon maken tussen 2N- en 4N-DNA. Om celcyclusfasen te definiëren, ontwikkelde Behbehani een methode die IdU gebruikt met een massa van 127, die binnen het bereik van de massacytometer valt en directe meting van cellen in S-fase3 mogelijk maakt. Deze directe meting omzeilt de noodzaak van secundaire antilichamen of het gebruik van DNA-denatureringsmiddelen zoals zuur of DNase. In combinatie met intracellulaire cyclusmarkers maakt het een hoge resolutie van celcyclusverdeling in experimentele modellen mogelijk.
Dit protocol past celcyclusmetingen aan van gangbare flowcytometrieprotocollen voor MCM. Onze methoden bieden een handige en eenvoudige manier om celcyclusparameters op te nemen. IdU-opname van in vitro monsters vereist slechts 10 tot 15 minuten incubatie bij 37 °C, wat korter is dan de meeste BrdU-kleuringsprotocollen die incubatietijden van enkele uren aanbevelen 3,7. IdU- en BrdU-geïncorporeerde monsters kunnen worden gefixeerd met behulp van een proteomische stabilisator en vervolgens enige tijd worden bewaard in een vriezer van -80 °C. Hierdoor kunnen grote aantallen IdU-gekleurde monsters worden gearchiveerd voor batchanalyse zonder dat de monsterkwaliteit wordt verminderd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde voorbeelden laten zien hoe u een MCM-platform kunt gebruiken om de distributie van de celcyclus te analyseren. Het is ook aangetoond dat celcyclusanalyse gevoelig is voor experimentele omstandigheden zoals tijd en temperatuur, wat een belangrijke overweging is die onderzoekers moeten nemen bij het overwegen van MCM voor hun celcyclusanalyse14. Monsters die gedurende een korte periode in opslag worden achtergelaten, niet langer dan een uur, hebben een IdU-opname die vergelijk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de inspanningen van Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang en Justin Lyeberger bedanken voor hun experimentele steun. Dit werk werd ondersteund door het Pelotonia Fellowship Program. Alle meningen, bevindingen en conclusies die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteur (s) en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs die van het Pelotonia Fellowship-programma. “
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).
- Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
- Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).
- Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
- Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).
- Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).
- Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
- Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
- Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).
- Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).
