Bir Kütle Sitometri Platformunda Hücre Döngüsü Fazları Oluşturmak için Pirimidin Analogu, 5-İyodo-2′-Deoksiüridin (IdU) Hücre Döngüsü Belirteçleri ile Kullanımı
Summary
Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini bir kütle sitometri platformunda kullanılmak üzere uyarlar. Kütle sitometrisinin çok parametreli yetenekleriyle, iyot katılımının doğrudan ölçümü, S-fazındaki hücrelerin tanımlanmasına izin verirken, hücre içi döngü belirteçleri, her bir hücre döngüsü durumunun bir dizi deneysel koşulda karakterizasyonunu sağlar.
Abstract
Hücre döngüsü fazının düzenlenmesi, hücresel proliferasyon ve homeostazın önemli bir yönüdür. Hücre döngüsünü yöneten düzenleyici mekanizmaların bozulması, kanser de dahil olmak üzere bir dizi hastalığın bir özelliğidir. Hücre döngüsünün incelenmesi, hücre döngüsü ilerlemesinin her bir bölümündeki hücre sayısını tanımlamanın yanı sıra her hücre döngüsü fazı arasında açıkça tanımlama yeteneğini gerektirir. Kütle sitometrisinin (MCM) ortaya çıkışı, elementel izotopların doğrudan ölçümleri yoluyla yüksek verimli tek hücre analizi için muazzam bir potansiyel sağlar ve MCM tarafından hücre döngüsü durumunu ölçmek için bir yöntemin geliştirilmesi, MCM’nin faydasını daha da genişletir. Burada, bir MCM sisteminde 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) benzeri 5-iodo-2′-deoksiüridin (IdU) ‘yi doğrudan ölçen bir yöntemi açıklıyoruz. Bu IdU tabanlı MCM’nin kullanımı çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, IdU, sentezi sırasında DNA’ya hızla dahil edilir ve S-fazındaki hücrelerin 10-15 dakika kadar kısa inkübasyonlarla güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar. İkincisi, IdU, ikincil antikorlara ihtiyaç duymadan veya DNA yıkımına ihtiyaç duymadan ölçülür. Üçüncüsü, IdU boyaması, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile histon H3 (pHH3) ölçümü ile kolayca birleştirilebilir ve bu da toplu olarak beş hücre döngüsü fazının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu hücre döngüsü belirteçlerinin MCM ile mümkün olan çok sayıda parametre ile kombinasyonu, diğer birçok metrikle kombinasyona izin verir.
Introduction
Kütle sitometrisi, kütle spektroskopisinin yüksek çözünürlüklü ve kantitatif doğasından yararlanarak yaklaşık 40 parametrenin tespit edilmesini sağlar. Metal etiketli antikorlar, daha fazla sayıda kanala izin veren ve minimum yayılma üreten florofor konjuge antikorlar yerine kullanılır 1,2. MCM, akış sitometrisine kıyasla hücre döngüsü analizi açısından avantaj ve dezavantajlara sahiptir. MCM’nin en büyük avantajlarından biri, çok sayıda parametrenin, oldukça heterojen örneklerde çok sayıda immünofenotipik olarak farklı T hücresi tipinde hücre döngüsü durumunun eşzamanlı olarak ölçülmesini sağlamasıdır. MCM, insan kemik iliği3 ve telomeraz eksikliğinin transgenik murin modellerinde normal hematopoez sırasında hücre döngüsü durumunu ölçmek için başarıylakullanılmıştır. Akut miyeloid lösemide (AML) hücre döngüsü durumunun analizi, hücre döngüsünün klinik tedavilere bilinen yanıtlarla ilişkili olduğunu ve tedavi seçimlerini bilgilendirebilecek fonksiyonel özelliklere in vivo bir bakış açısı sağladığını göstermiştir5. Kütle sitometrik hücre döngüsü analizinin ikinci bir avantajı, hücre döngüsü durumu ile ilişkili olabilecek çok sayıda başka fonksiyonel belirteci ölçme yeteneğidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, protein ve RNA sentezini, BRU ve rRNA6’ya karşı IdU ve metal etiketli antikorların kullanımı yoluyla hücre döngüsü durumu ile ilişkilendirebilmiştir. Bir farklılaşma sürekliliğinde çok sayıda popülasyonda hücre döngüsü durumunu ölçen bu tür yüksek parametrik analizler, mevcut akış sitometri teknolojisi ile neredeyse imkansız olacaktır. MCM’nin en büyük dezavantajı, floresan akış sitometrisinde kullanılanlarla karşılaştırılabilir DNA veya RNA lekelerinin olmamasıdır (örneğin, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, vb.). Floresan boyalar, DNA ve RNA içeriğinin nispeten hassas ölçümlerini verebilir, ancak bu hassasiyet yalnızca nükleotid bazları arasındaki interkalasyon sırasında meydana gelen bu boyaların floresan özelliklerindeki değişiklikler nedeniyle mümkündür. MCM analizi bu nedenle DNA veya RNA içeriğini benzer hassasiyetle ölçemez. Bunun yerine, kütle sitometrik hücre döngüsü analizi, siklin B1, fosforile retinoblastoma proteini (pRb) ve fosforile Histon H3 (pHH3) gibi hücre döngüsü durumuyla ilgili proteinlerin ölçümlerine ve IdU’nun S-faz hücrelerine dahil edilmesinden iyot atomunun doğrudan ölçümüne dayanır. Bu iki ölçüm yaklaşımı, normal hücresel proliferasyon sırasında oldukça benzer sonuçlar verir, ancak hücre döngüsü ilerlemesi bozulduğunda potansiyel olarak uyumsuz olabilir.
Her hücre döngüsü fazındaki hücre sayısının ölçülmesi, normal hücre döngüsü gelişiminin yanı sıra kanserlerde ve immünolojik hastalıklarda yaygın olarak gözlenen hücre döngüsü bozulmasını anlamada önemlidir. MCM, metal etiketli antikorlar kullanarak hücre dışı ve hücre içi faktörlerin güvenilir ölçümünü sağlar; Bununla birlikte, iridyum bazlı DNA interkalatörü 2N ve 4N DNA arasında ayrım yapamadığı için S-fazının ölçümü sınırlıydı. Hücre döngüsü fazlarını tanımlamak için Behbehani, kütle sitometresinin aralığına giren ve S-faz3’teki hücrelerin doğrudan ölçülmesine izin veren 127 kütleli IdU’yu kullanan bir yöntem geliştirdi. Bu doğrudan ölçüm, ikincil antikorlara olan ihtiyacı veya asit veya DNaz gibi DNA denatüre edici ajanların kullanımını ortadan kaldırır. Hücre içi döngü belirteçleri ile birlikte, deneysel modellerde hücre döngüsü dağılımının yüksek çözünürlüğüne izin verir.
Bu protokol, hücre döngüsü ölçümlerini MCM için ortak akış sitometri protokollerinden uyarlar. Yöntemlerimiz, hücre döngüsü parametrelerini dahil etmek için uygun ve basit bir yol sağlar. İn vitro numunelerin IdU ile dahil edilmesi, 37 ° C’de sadece 10 ila 15 dakikalık inkübasyon gerektirir; bu, birkaç saatlik inkübasyon süreleri öneren çoğu BrdU boyama protokolünden daha kısadır 3,7. IdU ve BrdU dahil numuneler bir proteomik stabilizatör kullanılarak sabitlenebilir ve daha sonra -80 ° C’lik bir dondurucuda bir süre saklanabilir. Bu, çok sayıda IdU boyalı numunenin, numune kalitesinde bir azalma olmadan parti analizi için arşivlenmesini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan örnekler, hücre döngüsü dağılımını analiz etmek için bir MCM platformunun nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, hücre döngüsü analizinin zaman ve sıcaklık gibi deneysel koşullara duyarlı olduğu gösterilmiştir; bu, araştırmacıların hücre döngüsü analizleri için MCM’yi düşünürken göz önünde bulundurmaları gereken önemli bir husustur14. Bir saatten fazla olmamak üzere kısa bir süre için depoda bırakılan örnekler, normal duru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, deneysel destekleri için Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang ve Justin Lyeberger’in çabalarına teşekkür eder. Bu çalışma Pelotonia Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç, yazar(lar)a aittir ve Pelotonia Burs Programı’nınkileri yansıtmak zorunda değildir.”
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).
- Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
- Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).
- Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
- Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).
- Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).
- Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
- Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
- Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).
- Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).
