세포 주기 마커와 함께 피리미딘 유사체, 5-요오도-2′-데옥시우리딘(IdU)을 사용하여 질량 세포분석 플랫폼에서 세포 주기 단계 설정
Summary
이 프로토콜은 질량 세포 분석 플랫폼에서 사용하기 위해 세포 주기 측정을 조정합니다. 질량 세포분석의 다중 파라미터 기능을 통해 요오드 결합을 직접 측정하면 S상에서 세포를 식별할 수 있으며 세포 내 사이클링 마커를 통해 다양한 실험 조건에서 각 세포 주기 상태를 특성화할 수 있습니다.
Abstract
세포주기 단계의 조절은 세포 증식 및 항상성의 중요한 측면입니다. 세포주기를 지배하는 조절 메커니즘의 붕괴는 암을 포함한 여러 질병의 특징입니다. 세포주기에 대한 연구는 세포주기 진행의 각 부분에서 세포 수를 정의하고 각 세포주기 단계 사이를 명확하게 묘사하는 능력을 필요로합니다. 질량 세포분석법(MCM)의 출현은 원소 동위원소의 직접 측정을 통해 고처리량 단일 세포 분석에 대한 엄청난 잠재력을 제공하며, MCM에 의한 세포 주기 상태를 측정하는 방법의 개발은 MCM의 유용성을 더욱 확장합니다. 여기에서는 MCM 시스템에서 5-브로모-2′-데옥시유리딘(BrdU)과 유사한 5-요오도-2′-데옥시우리딘(IdU)을 직접 측정하는 방법을 설명합니다. 이 IdU 기반 MCM을 사용하면 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, IdU는 합성 과정에서 DNA에 빠르게 통합되어 10-15분의 짧은 배양으로 S상 세포를 안정적으로 측정할 수 있습니다. 둘째, IdU는 2차 항체나 DNA 분해가 필요 없이 측정됩니다. 셋째, IdU 염색은 사이클린 B1, 인산화된 망막모세포종 단백질(pRb) 및 인산화된 히스톤 H3(pHH3)의 측정과 쉽게 결합될 수 있으며, 이는 5가지 세포 주기 단계를 집합적으로 명확하게 설명합니다. 이러한 세포 주기 마커와 MCM으로 가능한 많은 수의 매개변수의 조합은 수많은 다른 지표와 결합을 가능하게 합니다.
Introduction
질량 세포 분석은 질량 분광법의 고분해능 및 정량적 특성을 활용하여 약 40개의 파라미터를 검출할 수 있습니다. 더 많은 수의 채널을 허용하고 최소 스필오버(spillover)를 생성하는 형광단 접합 항체 대신 금속 표지 항체가 사용됩니다 1,2. MCM은 유세포 분석과 비교하여 세포 주기 분석과 관련하여 장점과 단점이 있습니다. MCM의 주요 이점 중 하나는 많은 수의 파라미터를 통해 매우 이질적인 샘플에서 많은 수의 면역 표현형으로 구별되는 T 세포 유형에 걸쳐 세포 주기 상태를 동시에 측정할 수 있다는 것입니다. MCM은 텔로머라아제 결핍증의 인간 골수3 및 형질전환 쥐 모델에서 정상적인 조혈 동안 세포 주기 상태를 측정하는 데 성공적으로 사용되었습니다4. 급성 골수성 백혈병(AML)의 세포 주기 상태를 분석한 결과, 세포 주기가 임상 요법에 대한 알려진 반응과 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 치료법 선택에 정보를 제공할 수 있는 기능적 특성에 대한 생체 내 통찰력을 제공한다5. 질량 세포 분석 세포 주기 분석의 두 번째 이점은 세포 주기 상태와 상관관계가 있을 수 있는 많은 다른 기능적 마커를 측정할 수 있다는 것입니다. 최근 연구에서는 IdU 및 BRU 및 rRNA에 대한 금속 태그 항체를 사용하여 단백질 및 RNA 합성을 세포 주기 상태와 연관시킬 수 있었습니다6. 분화 연속체에서 수많은 집단에 걸쳐 세포 주기 상태를 측정하는 이러한 종류의 고도의 매개변수 분석은 현재의 유세포 분석 기술로는 거의 불가능합니다. MCM의 주요 단점은 형광 유세포 분석에 사용되는 것과 유사한 DNA 또는 RNA 염색(예: DAPI, Hoechst, Pyronin Y 등)이 없다는 것입니다. 형광 염료는 DNA 및 RNA 함량을 비교적 정밀하게 측정할 수 있지만, 이러한 정밀도는 뉴클레오티드 염기 사이의 삽입시 발생하는 이러한 염료의 형광 특성의 변화로 인해 가능합니다. 따라서 MCM 분석은 유사한 정밀도로 DNA 또는 RNA 함량을 측정할 수 없습니다. 대신, 질량 세포 분석 세포 주기 분석은 사이클린 B1, 인산화된 망막모세포종 단백질(pRb) 및 인산화된 히스톤 H3(pHH3)와 같은 세포 주기 상태와 관련된 단백질의 측정과 IdU 결합에서 S상 세포로의 요오드 원자의 직접 측정에 의존합니다. 이 두 가지 측정 접근법은 정상적인 세포 증식 동안 매우 유사한 결과를 산출하지만 세포주기 진행이 중단 될 때 잠재적으로 불일치 할 수 있습니다.
각 세포주기 단계에서 세포 수의 측정은 암 및 면역 질환에서 일반적으로 관찰되는 세포주기 파괴뿐만 아니라 정상적인 세포주기 발달을 이해하는 데 중요합니다. MCM은 금속 표지 항체를 사용하여 세포외 및 세포내 인자의 신뢰할 수 있는 측정을 제공합니다. 그러나 이리듐계 DNA 인터칼레이터는 2N과 4N DNA를 구별할 수 없었기 때문에 S상 측정이 제한적이었다. 세포주기 단계를 정의하기 위해 Behbehani는 질량 세포 분석기의 범위에 속하고 S 상3에서 세포를 직접 측정 할 수있는 질량 127의 IdU를 활용하는 방법을 개발했습니다. 이러한 직접 측정은 2차 항체의 필요성이나 산 또는 DNase와 같은 DNA 변성제의 사용을 우회합니다. 세포 내 사이클링 마커와 함께 실험 모델에서 세포주기 분포의 고분해능을 허용합니다.
이 프로토콜은 MCM에 대한 일반적인 유세포 분석 프로토콜의 세포 주기 측정을 조정합니다. 우리의 방법은 세포주기 매개 변수를 포함하는 편리하고 간단한 방법을 제공합니다. 시험관 내 샘플의 IdU 통합은 37°C에서 10-15분의 배양만 필요로 하며, 이는 수 시간의 배양 시간을 권장하는 대부분의 BrdU 염색 프로토콜보다 짧습니다 3,7. IdU 및 BrdU 혼입 샘플은 -80°C 냉동고에 일정 시간 동안 보관한 후 단백질체 안정화제를 사용하여 고정할 수 있습니다. 이를 통해 샘플 품질의 저하 없이 배치 분석을 위해 많은 수의 IdU 염색 샘플을 보관할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 예는 MCM 플랫폼을 사용하여 세포 주기 분포를 분석하는 방법을 보여줍니다. 또한 세포 주기 분석은 시간 및 온도와 같은 실험 조건에 민감하다는 것이 입증되었으며, 이는 연구자들이 세포 주기 분석을 위해 MCM을 고려할 때 반드시 고려해야 할 중요한 사항이다14. 한 시간 이하의 짧은 기간 동안 보관된 샘플은 정상 상태와 유사한 IdU 통합을 갖습니다. 장기간(약 2?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 실험적 지원에 대해 Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang 및 Justin Lyeberger의 노력에 감사드립니다. 이 작업은 Pelotonia Fellowship Program의 지원을 받았습니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 결과 및 결론은 저자의 것이며 반드시 Pelotonia Fellowship Program의 의견을 반영하는 것은 아닙니다.”
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
References
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