पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके Pharyngeal आर्क धमनियों का दृश्य और विश्लेषण
Summary
यहां, हम पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ऊतक समाशोधन, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके फैरिंगियल आर्क धमनियों 3, 4 और माउस भ्रूण के 6 की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
मूत्रार्ज आर्क धमनियों (PAAs) 3, 4, और 6 के अनुचित गठन या रीमॉडलिंग जन्मजात हृदय रोग के सबसे गंभीर रूपों में से कुछ में योगदान करते हैं। PAAs के गठन का अध्ययन करने के लिए, हम पूरे माउंट प्रतिकार का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल विकसित बेंजाइल शराब के साथ मिलकर/ यह एक ठीक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ-साथ वास्कुलचर की 3डी कनेक्टिविटी पर फैरिंगल आर्क एंडोथेलियम के दृश्य के लिए अनुमति देता है। सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, हमने पीएए में एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के साथ-साथ फैरिंगियल मेहराब 3, 4 और 6 के भीतर पीए के आसपास के संवहनी जाल के भीतर ईसीएस की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है। जब पूरे भ्रूण पर लागू किया जाता है, तो यह पद्धति भ्रूणीय वास्कुलचर का एक व्यापक दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करती है।
Introduction
माउस भ्रूण उत्पत्ति के दौरान, फरियांगल आर्क धमनियां (PAAs) धमनियों के सममित, द्वि-पार्श्व जोड़े के रूप में उत्पन्न होती हैं जो दिल को पृष्ठीय महाधमनी1से जोड़ती हैं। जैसे-जैसे भ्रूण विकसित होता है, पीएए के पहले और दूसरे जोड़े पीछे हटजाते हैं, जबकि3,4और6 पीए महाधमनी आर्क धमनियों2बनाने के लिए विषम रीमॉडलिंग घटनाओं की एक श्रृंखला से गुजरते हैं।
PAAs 3, 4 और 6 वास्कुलोजेनेसिस के माध्यम से विकसित होता है, जो रक्त वाहिकाओं का डी नोवो गठनहै 3। इन कट्टर धमनियों के गठन या रीमॉडलिंग में दोष विभिन्न जन्मजात हृदय दोषों को जन्म देते हैं, जैसे कि डिजॉर्ज सिंड्रोम4,5के रोगियों में देखे जाते हैं। इसलिए, PAAs के विकास को विनियमित करने वाले तंत्रों को समझना जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) एटिजियोलॉजी की बेहतर समझ पैदा कर सकता है।
पीएए विकास की कल्पना और विश्लेषण के लिए वर्तमान दृष्टिकोणों में ऊतक वर्गों की प्रतिरक्षण, संवहनी डाले, भारत स्याही इंजेक्शन, उच्च संकल्प एपिस्कोपिक माइक्रोस्कोपी, और/या पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री1,,4,,5,,6,,7शामिल हैं । इसके साथ, हम वॉल्यूमेट्रिक डेटा, वैस्कुलर कनेक्टिविटी और सेल पहचान को इकट्ठा करने, विश्लेषण करने और निर्धारित करने के लिए पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3डी इमेज रेंडरिंग के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम प्रत्येक फैरिंगियल आर्क में ईसीएस की संख्या को विभाजित करने और निर्धारित करने की एक विधि का विस्तार करते हैं, जो प्रत्येक फैरिंगियल आर्क वैस्कुलर प्लेक्सस के गठन और पीए में इसके पुनर्मॉडलिंग का अध्ययन करने के साधन के रूप में है। हालांकि यह प्रोटोकॉल पीएए विकास का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है, इसका उपयोग अन्य विकासशील संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
3 डी में माउस भ्रूण में एंडोथेलियम की कल्पना करने की क्षमता ने उनके विकास3में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की है । यहां हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो भ्रूण के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी इमेजिंग, संवहनी कने…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि को सावधानीपूर्वक पढ़ने और संपादन के लिए ब्रिएना अलेक्जेंडर, काओलान ओ डोनेल और माइकल वारकला का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान के एनआईएच R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 से एसए के वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था; एजेआर को NHLBI HL103920-08S1 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज ट्रेनिंग ग्रांट T32052283-11 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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