Visualización y análisis de arterias de arco faríngeo utilizando inmunohistoquímica de montaje completo y reconstrucción 3D
Summary
Aquí, describimos un protocolo para visualizar y analizar las arterias del arco faríngeo 3, 4 y 6 de embriones de ratón utilizando inmunofluorescencia de montaje completo, limpieza de tejidos, microscopía confocal y reconstrucción 3D.
Abstract
La formación o remodelación inadecuadas de las arterias del arco faríngeo (PAA) 3, 4 y 6 contribuyen a algunas de las formas más graves de cardiopatía congénita. Para estudiar la formación de PAA, desarrollamos un protocolo utilizando inmunofluorescencia integral junto con la limpieza de tejido de alcohol bencílico/benzilo bencílico (BABB), y microscopía confocal. Esto permite la visualización del endotelio del arco faríngeo a una resolución celular fina, así como la conectividad 3D de la vasculatura. Utilizando software, hemos establecido un protocolo para cuantificar el número de células endoteliales (ECs) en PAA, así como el número de ECs dentro del plexo vascular que rodea a los PAA dentro de los arcos faríngeos 3, 4 y 6. Cuando se aplica a todo el embrión, esta metodología proporciona una visualización integral y un análisis cuantitativo de la vasculatura embrionaria.
Introduction
Durante la embriogénesis del ratón, las arterias del arco faríngeo (PAA) surgen como pares simétricos, bilaterales de arterias que conectan el corazón con las aortas dorsales1. A medida que el embrión se desarrolla, el primer y segundo par de PAA retroceden, mientras que losPAA 3,4y 6 se someten a una serie de eventos de remodelación asimétrica para formar las arterias del arco aórtico2.
Los PAA 3, 4 y 6 se desarrollan a través de vasculogénesis, que es la formación de novo de los vasos sanguíneos3. Los defectos en la formación o remodelación de estas arterias del arco dan lugar a diversos defectos cardíacos congénitos, como los observados en pacientes con Síndrome de DiGeorge4,5. Por lo tanto, comprender los mecanismos que regulan el desarrollo de los PAA puede conducir a una mejor comprensión de la etiología de las enfermedades cardíacas congénitas ( CHD).
Los enfoques actuales para visualizar y analizar el desarrollo de PAA incluyen inmunofluorescencia de secciones tisulares, moldes vasculares, inyección de tinta de la India, microscopía episcópica de alta resolución y/o inmunohistoquímica de montaje completo1,4,5,6,7. Aquí, describimos un protocolo que combina inmunofluorescencia de montaje completo, microscopía confocal y renderizado de imágenes 3D con el fin de recopilar, analizar y cuantificar datos volumétricos, conectividad vascular e identidad celular. Además, detallamos un método para compartimentar y cuantificar el número de CE en cada arco faríngeo como un medio para estudiar la formación del arco faríngeo plexo vascular y su remodelación en los PAA. Si bien este protocolo está diseñado para analizar el desarrollo de PAA, se puede utilizar para analizar otras redes vasculares en desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de visualizar el endotelio en embriones de ratón en 3D ha proporcionado nuevas perspectivas sobre su desarrollo3. Aquí presentamos un protocolo que permite la toma de imágenes 3D de alta resolución de embriones, la visualización de la conectividad vascular y los análisis cuantitativos de la formación de PAA. Este protocolo se puede emplear para ver cómo las alteraciones genéticas o los insultos ambientales afectan el desarrollo de la PAA. El procedimiento descrito aquí utili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O’Donnell y Michael Warkala por la lectura y edición cuidadosa de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la financiación del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR cuenta con el apoyo de NHLBI HL103920-08S1 y la beca T32052283-11 del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de La Piel.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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