Summary

Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi

Published: March 31, 2020
doi:

Summary

Burada, faringeal kemer arterlerin 3, 4 ve 6’sını tam montaj lı immünororesans, doku temizleme, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak görselleştirmek ve analiz etmek için bir protokol uyguluyoruz.

Abstract

Faringeal kemer arterlerin (PAAs) 3, 4 ve 6’nın yanlış oluşumu veya yeniden biçimlendirilmesi konjenital kalp hastalığının en şiddetli formlarından bazılarına katkıda bulunur. PAAs oluşumunu incelemek için, benil alkol /benzil benzoat (BABB) doku temizleme ve konfokal mikroskopi ile birleştiğinde tam montaj immünororesans kullanarak bir protokol geliştirdik. Bu ince bir hücresel çözünürlükte faringeal kemer endotel görselleştirme yanı sıra vaskülatür 3D bağlantısı sağlar. Yazılımı kullanarak, PAAs endotel hücrelerinin (ECs) sayısını ölçmek için bir protokol kurduk, yanı sıra faringeal kemerler içinde PAAs çevreleyen vasküler pleksus içinde ECs sayısı 3, 4, ve 6. Tüm embriyouygulandığında, bu metodoloji embriyonik vaskülatür kapsamlı bir görselleştirme ve kantitatif analiz sağlar.

Introduction

Fare embriyogenezi sırasında, faringeal arch arterler (PAAs) dorsal aort ile kalp bağlamak arterlerin simetrik, çift taraflı çiftleri olarak ortaya çıkar1. Embriyo geliştikçe, PAAs ilk ve ikinci çiftleri regress, süre 3,4th, ve6 PAAs aort kemer arterler oluşturmak için asimetrik remodeling olaylar bir dizi geçmesi2.

PAAs 3, 4 ve 6 vaskülogenez yoluyla gelişir, hangi kan damarlarının de novo oluşumudur3. Bu kemer arterlerin oluşumu veya remodeling kusurları çeşitli konjenital kalp defektleri yol açar, DiGeorge Sendromu olan hastalarda görülen gibi4,5. Bu nedenle PAA’ların gelişimini düzenleyen mekanizmaların anlaşılması konjenital kalp hastalığı (KH) etiyolojisinin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

PAA gelişimini görselleştirmek ve analiz etmek için güncel yaklaşımlar arasında doku kesitlerinin immünororesansı, vasküler dökümler, Hindistan mürekkep enjeksiyonu, yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi ve/veya tam montajlı immünohistokimya1,4,5,,6,7sayılabilir. Burada, hacimsel verileri, vasküler bağlanabilirliği ve hücre kimliğini toplamak, analiz etmek ve ölçmek için tam bir immünofofloresans, konfokal mikroskopi ve 3Boyutlu görüntü oluşturmayı birleştiren bir protokol tanımlıyoruz. Ayrıca, faringeal kemer vasküler pleksus oluşumu nu incelemek ve PAAs içine remodeling bir araç olarak her faringeal kemer EC’lerin sayısını bölümlere ayırmak ve ölçmek için bir yöntem detay. Bu protokol PAA gelişimini analiz etmek için tasarlanmış olsa da, diğer gelişmekte olan vasküler ağları analiz etmek için kullanılabilir.

Protocol

Hayvan kullanımı ve prosedürleri Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. 1. Çözümlerin hazırlanması %0,1 Triton-X-100 (PBST) ile 1 L fosfat tamponlu tuzlu su hazırlayın ve sterilize edin. Bu çözelti en az bir yıl oda sıcaklığında (RT) saklanabilir. PBST’de normal eşek serumunun ‘undan oluşan 600 μL bloke tamponhazırlayın. Bu çözümü her seferinde taze yapın. Bir akış kaputunda aşağ…

Representative Results

Burada sunulan tüm montaj immünofloresan protokolü net ve temiz sonuçlar üretir, faringeal kemer endotel 3D rekonstrüksiyonu için izin, Şekil 1Agörüldüğü gibi . Her antikor çözeltisinde yeterli miktarda embriyo kuluçkaya yatırılması ve antikor kuluçka sonrası embriyoların iyice yıkanması önemlidir. Şekil 1B’debüyük, parlak nokta, antikorveya engelleme tampon çözeltil…

Discussion

3D fare embriyolarında endotel görselleştirmek için yeteneği onların gelişimi içine yeni anlayışlar sağlamıştır3. Burada embriyoların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme, vasküler bağlantı nın görselleştirilmesi ve PAA oluşumunun kantitatif analizleri için izin veren bir protokol sıyoruz. Bu protokol, genetik değişikliklerin veya çevresel hakaretlerin PAA gelişimini nasıl etkilediğini görmek için kullanılabilir. Burada bildirilen prosedür, PAA oluşumunu …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Brianna Alexander, Caolan O’Donnell ve Michael Warkala’ya bu el yazmasının dikkatli okumaları ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 SA tarafından finanse edildi; AJR NHLBI HL103920-08S1 ve Ulusal Artrit Enstitüsü ve Kas-Iskelet ve Cilt Hastalıkları Eğitimi hibe T32052283-11 tarafından desteklenir.

Materials

10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

References

  1. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
  2. Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
  3. Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
  4. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  5. Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
  6. Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
  7. Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
  8. Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
  9. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
  10. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  12. Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
  13. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  14. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).

Play Video

Cite This Article
Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

View Video