遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用
Summary
ここでは、1細胞胚の凍結保存のための改変方法と、遺伝子組換えマウスの効率的な生成のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせたプロトコルを提示する。
Abstract
遺伝子組み換え(GM)マウスの使用は、遺伝子機能を理解し、ヒト疾患の基礎となるメカニズムを解読するために重要になっています。CRISPR/Cas9システムにより、研究者は前例のない効率、忠実性、シンプルさでゲノムを改変することができます。この技術を活用して、研究者はGMマウスを生成するための迅速で効率的で簡単なプロトコルを求めています。ここでは、凍結解凍胚の発達率を高める一細胞胚の凍結保存のための改良された方法を紹介する。このプロトコルは、最適化されたエレクトロポレーション条件と組み合わせることで、短時間で高効率で低いモザイクレートでノックアウトマウスとノックインマウスを生成することができます。さらに、CRISPR試薬の調製、体外受精、1細胞胚の凍結保存と解凍、CRISPR試薬のエレクトロポレーション、マウス生成、および創始者のジェノタイピングをカバーし、最適化されたプロトコルの段階的な説明を示します。このプロトコルを使用して、研究者は比類のない容易さ、速度、および効率でGMマウスを準備することができるはずです。
Introduction
クラスター化された定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)システムは、ゲノム1に前例のない標的修飾を提供する科学的ブレークスルーである。CRISPR/Cas9システムはCas9タンパク質およびガイドRNA(gRNA)と2つの分子成分で構成される:標的特異的CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)2。2gRNAは、Cas9タンパク質をゲノム中の特異的な遺伝子座に導き、crRNAに相補的な20ヌクレオチド、およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する。Cas9タンパク質は、標的配列に結合し、エラーが起こりやすい非相同末端結合(NHEJ)または高忠実相同症指向修復(HDR)3、4、5のいずれかによって修復される二本鎖破断(DSB)を誘導する。3,4,5NHEJは挿入および/および/および欠失(インデル)を導き、したがって、コード配列が標的とされるときの機能の遺伝子喪失につながる。HDRは、相同性配列,3、4、54を含む修復テンプレートの存在3下で正確なゲノム編集を導く。NHEJとHDRは、ノックアウトマウスとノックアウトマウスをそれぞれ生成するために利用されています。
CRISPR/Cas9システムは、優れた有効性と忠実度を持つGMマウスの生成を著しく加速していますが、これらの方法を適用する科学者はしばしば技術的な課題に遭遇します。まず、従来のプロトコルは、受精卵6、7の前核にCRISPR編集ツールを導入するためのマイクロインジェクションを必要とします。この手法は時間がかかり、通常は多くのトレーニングが必要です。したがって、いくつかのグループは、エレクトロ,ポレーション8、9、10、11、12、139,10,11でマイクロインジェクション12を13置き換えました。8しかし、初期のエレクトロポレーションプロトコルでは、新鮮な胚がエレクトロポレーションに使用された。これは、各実験の前に新鮮な胚を準備することは困難であるので、別の問題を引き起こした14.
最近、我々および他の人々は、ゲノム編集のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせ、GMマウス15,16,16の生成を容易にする。このプロトコルは、高度な胚操作スキルを持たない研究者が、高効率でヒト疾患の動物モデルを迅速に生成することを可能にする。このプロトコルはまた、創業者16における遺伝的不均一性などのGMマウスの生成における実用的な課題を大幅に軽減する。モザイクを克服するために、ゲノムの最初の複製の前に編集が行われることを確実にするために、胚解凍後1時間以内にCRISPR試薬のエレクトロポレーションを行います。別の改善は望ましくないモザイク化を減らすためにCas9 mRNAの代わりにCas9タンパク質の使用を含む17.さらに、2細胞段階16に対する発達速度を高める一細胞胚凍結保存法の最適な方法を開発しました:胎児ウシ血清(FBS)の使用は、凍結解凍未受精卵母細胞をより弾力性のある18にする同じメカニズムによって、受精後の凍結解凍卵母細胞の生存を劇的に改善します。
ここでは、1細胞C57BL/6J胚の凍結保存のための改変方法を含む、凍結解凍胚を用いたGMマウスの生成のための包括的なプロトコルを提示する。それは1)gRNA設計、CRISPR試薬の調製およびアセンブリを含んでいる;2)IVF、凍結保存、および一細胞胚の解凍。3) CRISPR試薬を凍結解凍胚にエレクトロポレーションする。4)偽妊娠雌マウスの卵管への胚移植;そして5)F0の創始動物のジェノタイピングとシーケンス分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されたプロトコルは、高効率かつ低いモザイク率を有するGMマウスの生成を可能にする(表1)。これは、生殖工学とゲノム編集技術の両方で最新かつ最も有用な進歩を利用して変異マウスを簡単に作成する高度な胚操作スキルを持たない研究者を可能にします: CRISPR/Cas9リボヌクレオプロテイン (RNP) と凍結解凍胚へのエレクトロポレーション.これらの進歩は、GMマウスの生成を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
澤田ひとみとエリザベス・ガルシアの動物ケアに感謝します。この研究は、KAKENHI(15K20134、17K11222、16H06276、16K01946)、北銀研究助成(H.N.)、吉地医科大学若手研究者賞(H.U.)によって支援されました。大塚と見学奨学財団は、M.D.を支援しました。
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
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