Использование замороженных оттаять эмбрионов для высокоэффективного производства генетически модифицированных мышей
Summary
Здесь мы представляем модифицированный метод криоконсервации одноклеточных эмбрионов, а также протокол, который соединяет использование замороженных оттаяющих эмбрионов и электропорации для эффективного поколения генетически модифицированных мышей.
Abstract
Использование генетически модифицированных (ГМ) мышей стало решающим фактором для понимания функции генов и расшифровки основных механизмов заболеваний человека. Система CRISPR/Cas9 позволяет исследователям изменять геном с беспрецедентной эффективностью, точностью и простотой. Используя эту технологию, исследователи ищут быстрый, эффективный и простой протокол для генерации ГМ мышей. Здесь мы внедряем усовершенствованный метод криоконсервации одноклеточных эмбрионов, что приводит к более высокой скорости развития замороженных оттаять эмбрионов. Комбинируя его с оптимизированными условиями электропорации, этот протокол позволяет в течение короткого времени выдвигать выбывающих и стук-в мышей с высокой эффективностью и низкими мозаичными ставками. Кроме того, мы показываем пошаговый разъяснение нашего оптимизированного протокола, охватывающего подготовку реагента CRISPR, экстракорпоральное оплодотворение, криоконсервацию и оттаивание одноклеточных эмбрионов, электропорацию реагентов CRISPR, генерацию мышей и генотипирование основателей. Используя этот протокол, исследователи должны быть в состоянии подготовить ГМ мышей с беспрецедентной легкостью, скоростью и эффективностью.
Introduction
Кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR)/CRISPR-ассоциированный белок 9 (Cas9) система является научным прорывом, который обеспечивает беспрецедентную целевую модификацию вгеноме 1. Система CRISPR/Cas9 состоит из белка Cas9 и направляющей РНК (gRNA) с двумя молекулярными компонентами: целевой РНК CRISPR (crRNA) и трансактивировавской РНК CRISPR (tracrRNA)2 . GRNA направляет белок Cas9 к специфическому локусу в геноме, 20 нуклеотидам, дополняют crRNA и примыкают к смежным мотивам протосказера (PAM). Cas9 белка связывается с целевой последовательности и вызывает двойные проломы (DSBs), которые восстанавливаются либо ошибка подверженных nonhomologous конец присоединения (NHEJ) или высокой точности гомологии направлены ремонт (HDR)3,4,5. NHEJ приводит к вставкам или/и удалениям (индельям) и, следовательно, к потере функции гена при целевой последовательности кодирования. HDR приводит к точному редактированию генома в присутствии шаблона ремонта, содержащего амологические последовательности3,,4,,5. NHEJ и HDR были использованы для создания нокаута и стук в мышей, соответственно.
В то время как система CRISPR/Cas9 заметно ускорила генерацию ГМ-мышей с выдающейся эффективностью и точностью, ученые, применяющие эти методы, часто сталкиваются с техническими проблемами. Во-первых, обычные протоколы требуют микроинъекции для внедрения инструментов редактирования CRISPR в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток6,,7. Этот метод занимает много времени и обычно требует обширной подготовки. Таким образом, несколько групп заменили микроинъекцию электропорацией88,9,,10,,11,,12,,13. Однако в ранних протоколах электропорации для электропорации использовались свежие эмбрионы. Это вызвало еще одну проблему, потому что подготовка свежих эмбрионов перед каждым экспериментом трудно14.
Недавно мы и другие объединили использование замораживающих оттепели эмбрионов и электропорации для редактирования генома, что облегчает генерацию ГМ мышей15,16. Этот протокол позволяет исследователям без предварительных искусств манипуляции зародыша быстро произвести животные модели людских заболеваний с высокой эффективностью. Протокол также значительно снижает практические проблемы в генерации ГМ мышей, такие как генетическая неоднородность у основателей16. Чтобы преодолеть мозаичность, мы выполняем электропорацию реагентов CRISPR в течение 1 ч после оттаивания эмбриона, чтобы обеспечить редактирование до первой репликации генома. Другое улучшение включает в себя использование белка Cas9 вместо Cas9 мРНК для уменьшения нежелательных мозаики17. Кроме того, мы разработали оптимальный метод криоконсервации одноклеточных эмбрионов, который увеличивает скорость развития до двухклеточной стадии16: использование сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) значительно улучшает выживаемость замороженных оттаять яоцитов после оплодотворения, возможно, тем же механизмом, который делает замораживание оттаяли неоплодное ооциты болееустойчивыми.
Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для генерации ГМ-мышей с использованием замороженных оттаять эмбрионов, в том числе модифицированный метод криоконсервации одноклеточных эмбрионов C57BL/6J. Она включает в себя 1) дизайн gRNA, подготовку реагента CRISPR и сборку; 2) ЭКО, криоконсервация и оттаивание одноклеточных эмбрионов; 3) Электропорация реагентов CRISPR в замораживание оттаяли эмбрионов; 4) Перенос эмбриона в яйцеклетку псевдобеременных самок мышей; и 5) Генотипирование и анализ последовательности животных-основателей F0.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол позволяет для поколения ГМ мышей с высокой эффективностью и низкими мозаичными ставками(таблица 1). Это позволяет исследователям без передовых навыков манипуляции эмбрионов для создания мутантных мышей легко, потому что он использует новейшие и наиболее п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Хитоми Саваду и Элизабет Гарсия за заботу о животных. Эта работа была поддержана KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 и 16K01946) и Хокугин исследований Грант (для H.N.), и Джичи Медицинский университет Молодой следователь премии (в H.U.). Стипендиальный фонд Отсуки Тошими поддержал докторов наук
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 발생학. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. 유전학. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. 발생학. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. 생체공학. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
