유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용
Summary
여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
유전자 변형 (GM) 마우스의 사용은 유전자 기능을 이해하고 인간 질병의 기본 메커니즘을 해독하는 데 중요해졌습니다. CRISPR/Cas9 시스템을 통해 연구자들은 전례 없는 효율성, 충실도 및 단순성으로 게놈을 수정할 수 있습니다. 이 기술을 활용하여 연구원들은 GM 마우스를 생성하기 위한 신속하고 효율적이며 쉬운 프로토콜을 찾고 있습니다. 여기에서 우리는 동결 해동 된 배아의 더 높은 발달 속도로 이어지는 1 세포 배아의 냉동 보존을위한 개선 된 방법을 소개합니다. 최적화된 전기 천공 조건과 결합함으로써 이 프로토콜은 짧은 시간 내에 고효율 및 낮은 모자이크 비율로 녹아웃 및 노크인 마우스를 생성할 수 있게 합니다. 또한, 우리는 CRISPR 시약 준비, 체외 수정, 동결 보존 및 1 세포 배아의 동결 보존 및 해동, CRISPR 시약의 전기 천공, 마우스 생성 및 설립자의 게놈을 포함하는 최적화 된 프로토콜에 대한 단계별 설명을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 연구원은 비교할 수 없는 용이성 GM 마우스를 준비 수 있어야, 속도, 그리고 효율성.
Introduction
클러스터된 정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 시스템은 게놈1에있는 전례 없는 표적으로 한 수정을 제공하는 과학적인 돌파구입니다. CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(gRNA)와 표적 특이적 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 CRISPR RNA(트라크RNA)2로 구성됩니다. gRNA는 Cas9 단백질을 게놈내의 특이적 궤적, 20개의 뉴클레오티드가 crRNA에 상보적이며, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접하여 지시한다. Cas9 단백질은 표적 서열에 결합하고 오류가 발생하기 쉬운 비동동성 단부 접합(NHEJ) 또는 고충실도 상동성 상동성 수리(HDR)3,,4,,5에의해 수리되는 이중 가닥 파손(DSB)을 유도합니다. NHEJ는 삽입 및 /및 삭제 (indels)로 이어지며, 따라서 코딩 서열이 표적화 될 때 기능의 유전자 손실로 이어집니다. HDR은 상동성 서열을 포함하는 복구 템플릿의 존재에 정확한 게놈 편집에 이르게3,,4,,5. NHEJ와 HDR은 각각 녹아웃 및 노크 인 마우스를 생성하기 위해 활용되었습니다.
CRISPR/Cas9 시스템은 뛰어난 효능과 충실도를 갖춘 GM 마우스의 생성을 현저히 가속화했지만, 이러한 방법을 적용하는 과학자들은 종종 기술적 인 과제를 겪습니다. 첫째, 종래의 프로토콜은 수정란6,,7의프로핵에 CRISPR 편집 도구를 도입하기 위한 미세 주입이 필요하다. 이 기술은 시간이 많이 걸리며 일반적으로 광범위한 교육이 필요합니다. 따라서 여러 그룹이 미세 주입을 전기 천공8,,9,10,,11,12,13으로대체했습니다. 그러나, 초기 전기 천공 프로토콜에서 신선한 배아는 전기 천공에 사용되었다. 이는 각 실험 전에 신선한 배아를 준비하는 것이 어렵기 때문에 또 다른 문제를 일으켰다14.
최근 우리및 다른 사람들은 동결해동배아의 사용을 결합하여 게놈 편집을 위한 전기포공화, 이는 GM마우스(15,,16)의생성을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 고급 배아 조작 기술이없는 연구원이 고효율로 인간 질병의 동물 모델을 신속하게 생성 할 수 있게합니다. 이 프로토콜은 또한 설립자16에서유전적 이질성과 같은 GM 마우스 생성에 대한 실질적인 과제를 현저히 감소시킨다. 모자이크주의를 극복하기 위해, 우리는 게놈의 첫 번째 복제 전에 편집이 발생하는지 확인하기 위해 배아 해동 후 1 시간 이내에 CRISPR 시약의 전기 천공을 수행합니다. 또 다른 개선은 바람직하지 않은 모자이크주의를 감소시키기 위해 Cas9 mRNA 대신 Cas9 단백질의 사용을 포함한다17. 또한, 우리는 2 세포 단계16에발달 속도를 증가시키는 1 세포 배아 동결 보존을위한 최적의 방법을 개발 : 태아 소 혈청 (FBS)의 사용은 극적으로 수정 후 동결 해동 oocytes의 생존을 향상, 아마도 동결 해동 비 수정 oocytes더탄력18을만드는 동일한 메커니즘에 의해.
여기에서 우리는 1 세포 C57BL/6J 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법을 포함하여 동결 해동 된 배아를 사용하여 GM 마우스의 생성을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 1) gRNA 설계, CRISPR 시약 제제 및 조립이 포함됩니다. 2) IVF, 동결 보존, 및 1 세포 배아의 해동; 3) CRISPR 시약의 전기 화동결 해동 배아; 4) 가성 임신 한 여성 마우스의 난관으로 배아 전달; 및 5) F0 설립자 동물의 게노티핑 및 서열 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
기재된 프로토콜은 높은 효율과 낮은 모자이크 레이트(표1)를가진 GM 마우스의 생성을 허용한다. CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로테인(RNP) 및 동결 해동 배아로의 전기 화: 생식 공학 및 게놈 편집 기술 모두에서 가장 유용한 최신의 진보를 활용하기 때문에 고급 배아 조작 기술이 없는 연구원은 돌연변이 마우스를 쉽게 만들 수 있습니다. 이러한 발전은 GM 마우스의 생성을 촉진하고 신속히 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
사와다 히토미와 엘리자베스 가르시아에게 동물 보호에 감사드립니다. 이 작품은 KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 및 16K01946)와 호쿠긴 연구 보조금 (H.N.에), 그리고 지치 의과 대학 젊은 조사상 (H.U.)에 의해 지원되었다. 오츠카 토시미 장학재단은 M.D.를 후원했습니다.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 발생학. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. 유전학. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. 발생학. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. 생체공학. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
