सेल फ्री बैक्टीरियल अर्क, लिपोसोम्स और इमल्शन ट्रांसफर का उपयोग करके प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल आरएनए और सिंथेटिक कोशिकाओं का उत्पादन करने वाले प्रोटीन की बॉटम-अप तैयारी के लिए विधि, सामग्री, उपकरण और चरणों का वर्णन करता है। सिंथेटिक कोशिकाओं के आंतरिक जलीय डिब्बे में पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि का उपयोग करके एक लिपिड बाइलेयर (यानी, स्थिर लिपोसोम) के भीतर S30 बैक्टीरियल लाइसेट को समाहित किया गया था।
Abstract
सिंथेटिक कोशिकाओं के निर्माण के लिए बॉटम-अप असेंबली दृष्टिकोण एक सेल नकल करने वाले वातावरण में सेलुलर प्रक्रियाओं को अलग करने और जांच करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। इसके अलावा, सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणालियों के विकास ने सिंथेटिक जीव विज्ञान का उपयोग करते हुए प्रोटीन उत्पादन, प्रतिलेखन और अनुवाद प्रक्रियाओं (डीएनए →आरएनए →प्रोटीन) का पुनर्गठन करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। यहां हम एक सेल-फ्री एक्सप्रेशन सिस्टम तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें सिंथेटिक कोशिकाओं के गठन के लिए कोलेस्ट्रॉल से भरपूर लिपिड आधारित विशाल यूनिमेलर वेसिकल्स (जीयूवी) (यानी स्थिर लिपोसोम) के अंदर एक शक्तिशाली बैक्टीरियल लाइसेट का उत्पादन और इस लाइकोसेट को encapsulating शामिल है। प्रोटोकॉल सक्रिय बैक्टीरियल lysates के उत्पादन सहित सिंथेटिक कोशिकाओं के घटकों को तैयार करने के तरीकों का वर्णन करता है, जिसके बाद पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि के आधार पर सिंथेटिक कोशिकाओं की विस्तृत कदम-दर-कदम तैयारी की जाती है। ये विभिन्न प्रकार के प्रोटीन के उत्पादन के लिए उच्च बहुमुखी प्रतिभा के साथ सरल और किफायती तरीके से लाखों सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन की सुविधा प्रदान करते हैं। प्राप्त सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग एक अलग वातावरण में प्रोटीन/आरएनए उत्पादन और गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है, निर्देशित विकास में, और शरीर के अंदर चिकित्सीय प्रोटीन के ऑन-डिमांड उत्पादन के लिए एक नियंत्रित दवा वितरण मंच के रूप में भी ।
Introduction
सिंथेटिक कोशिकाएं कृत्रिम कोशिका की तरह कण हैं, जो जीवित कोशिका के एक या कई कार्यों की नकल करते हैं, जैसे कि आनुवंशिक कोड1,2,2,3के आधार पर विभाजित करने की क्षमता, झिल्ली इंटरैक्शन और संश्लेषित प्रोटीन। सिंथेटिक कोशिकाएं जो कोशिका-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रणालियों को संलग्न करती हैं, डीएनए टेम्पलेट में परिवर्तन के बाद विभिन्न प्रोटीन और आरएनए दृश्यों का उत्पादन करने की क्षमता के कारण उच्च मॉड्यूलरता होती हैं। प्रोटीन उत्पादन के वर्तमान दृष्टिकोणों के लिए एक आकर्षक विकल्प पेश करते हुए, सीएफपीएस सिस्टम सेल लाइसेट, शुद्ध घटकों या सिंथेटिक घटकों पर आधारित हैं और इसमें प्रोटीन संश्लेषण के लिए आवश्यक सभी प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी शामिल हैं जैसे राइबोसोम्स, आरएनए बहुलक, अमीनो एसिड और ऊर्जा स्रोत (जैसे, 3-फॉस्होग्लेरेट और एडेनिन,7,ट्रिप्होस्फेट)8,944,5,,6, लिपिड वेसिकल्स के अंदर सीएफपीएस प्रणाली का एनकैप्सुलेशन जीवित कोशिका10के आधार पर प्रोटीन के सरल और कुशल उत्पादन को सक्षम बनाता है । इसके अलावा, यह प्लेटफ़ॉर्म पेप्टाइड्स के संश्लेषण की अनुमति देता है जो प्राकृतिक कोशिकाओं के अंदर नीचा हो सकते हैं, प्रोटीन का उत्पादन जो जीवित कोशिकाओं के लिए जहरीले हैं, और गैर-प्राकृतिक अमीनो एसिड11,,12के साथ प्रोटीन को संशोधित करते हैं। सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया है जो सेलुलर जीवन को विकासवादी परिप्रेक्ष्यसे सक्षमबनाने के लिए आवश्यक न्यूनतम कोशिका घटकों की जांच करते हैं 1,13. सिंथेटिक कोशिकाओं का उपयोग जेनेटिक सर्किट के निर्माण और कार्यान्वयन के लिए और निर्देशित विकास के लिए मॉडल के रूप में14,15,16के लिए भी किया गया है । अन्य अध्ययनों ने प्राकृतिक कोशिकाओं की जैविक गतिविधि की नकल करने के लिए सिंथेटिक कोशिकाओं की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसका उद्देश्य क्षतिग्रस्त प्राकृतिक कोशिकाओं को बदलना है, जैसे मधुमेह17के रोगियों में बीटा कोशिकाएं। इसके अलावा, इन सीएफपीएस की क्षमता सिंथेटिक कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार के चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए संलग्न करती है, जो नैदानिक उपयोग18में शामिल होने की क्षमता को दर्शाती है।
यहां हम एक लिपिड वेसिकल में समझाया एक CFPS प्रणाली के आधार पर आरएनए और प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक नीचे-अप प्रयोगशाला पैमाने पर प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का वर्णन करते हैं । यह वीवो19में चिकित्सीय प्रोटीन दवा के ऑनसाइट उत्पादन के लिए उपन्यास दवा वितरण प्रणालियों के रूप में सिंथेटिक सेल प्लेटफार्मों के संभावित उपयोग को दर्शाता है । पिछले अध्ययनों ने सीएफपीएस प्रतिक्रिया के अनुकूलन और सेल लाइसेट तैयारीप्रक्रिया4,8,20की जांच की है । इसके अलावा, सेल के आकार के लिपोसोम तैयारी के लिए कई तकनीकें लागू की गई हैं, जैसे माइक्रोफ्लूइडिक और बहुलक आधारित ड्रॉपलेट स्थिरीकरण विधियां21,,22,,23,जो लिपोसोम्स लिपिड संरचना24,25,,26में भी भिन्न होती हैं।, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, सिंथेटिक कोशिकाओं को पानी में तेल पायस हस्तांतरण विधि का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है और एन्कैप्सुलेशन प्रक्रिया कम तापमान (<4 डिग्री सेल्सियस)5,,10,24,,27,,28पर की जाती है।, ये हल्की परिस्थितियां आणविक मशीनरी की जैव-कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए अनुकूल पाई गई हैं, नामत राइबोसोम और प्रोटीन27,29,30। कणों की लिपिड संरचना में कोलेस्ट्रॉल और 1-पामोलिटोइल-2-ओलियोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (पीओसी) दोनों होते हैं। पहला सभी स्तनधारी कोशिका झिल्ली में पाया जाता है और झिल्ली की स्थिरता, कठोरता और परगम्यता में कमी के लिए आवश्यक है, और बाद में स्तनधारी फॉस्फोलिपिड संरचना11,,13की नकल करता है। सेलुलर ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद आणविक मशीनरी BL21 (DE3) एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) तनाव से निकाली जाती है, जो CFPS शक्ति और प्रोटीन संश्लेषण को बढ़ाने के लिए PAR1219 प्लाज्मिड ओवरएक्सप्रेसिंग T7 आरएनए बहुलक के साथ बदल जाती है। इस प्रणाली का उपयोग नैदानिक और चिकित्सीय प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए किया गया है, जिसमें 66 केडीए इन विट्रो और वीवो19,,31तक का आणविक वजन है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल सिंथेटिक सेल प्रणाली के उत्पादन के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करता है, जो प्रकृति में प्रोटीन संश्लेषण से जुड़े मौलिक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला को संबोधित कर सकता है और दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल प्रोटीन उत्पादक सिंथेटिक कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए एक सरल और सस्ती विधि का परिचय देता है। सक्रिय कोशिकाओं की उपज कई महत्वपूर्ण चरणों पर जोर देने के साथ प्रोटोकॉल के सावधा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ईआरसी-एसटीजी-2015-680242 ने सपोर्ट किया।
लेखक भी टेक्नियन इंटीग्रेटेड कैंसर सेंटर (टीआईसीसी) के समर्थन को स्वीकार करते हैं; रसेल बेरी नैनोटेक्नोलॉजी संस्थान; लॉरी I. Lokey इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर लाइफ साइंसेज एंड इंजीनियरिंग; एक Kamin अनुदान (52752) के लिए इसराइल अर्थव्यवस्था मंत्रालय; इज़राइल विज्ञान प्रौद्योगिकी और अंतरिक्ष मंत्रालय – मुख्य वैज्ञानिक का कार्यालय (3-11878); इज़राइल साइंस फाउंडेशन (1778/13, 1421/17); इज़राइल कैंसर एसोसिएशन (2015-0116); एक GIF युवा अनुदान के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान और विकास के लिए जर्मन-इजरायल फाउंडेशन (I-2328-1139.10/2012); एक कैरियर एकीकरण अनुदान (908049) के लिए यूरोपीय संघ एफपी-7 IRG कार्यक्रम; फॉस्फोलिपिड रिसर्च सेंटर ग्रांट; कैंसर अनुसंधान के लिए एक Rosenblatt फाउंडेशन, एक मल्लात परिवार फाउंडेशन अनुदान; और Unger परिवार फाउंडेशन । ए श्रोडर एलोन और तौब फैलोशिप को स्वीकार करता है । ओ Adir शर्मन और Gutwirth फैलोशिप स्वीकार करते हैं । जी चेन शर्मन फैलोशिप को स्वीकार करते हैं । एन क्रिंस्की रोथस्चिल्ड सीजेरिया फाउंडेशन से बैरोनेस एरियाने डी रोथस्चिल्ड वुमन डॉक्टोरल प्रोग्राम को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. | |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. . Biosynthesis of proteins inside liposomes. , 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
