Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.
L’approche d’assemblage ascendante pour la construction de cellules synthétiques est un outil efficace pour isoler et étudier les processus cellulaires dans un environnement imitant les cellules. En outre, le développement de systèmes d’expression sans cellules a démontré la capacité de reconstituer les processus de production, de transcription et de traduction de protéines (PROTÉINE DNA-ARN) d’une manière contrôlée, en exploitant la biologie synthétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d’un système d’expression sans cellules, y compris la production d’un puissant lysate bactérien et l’encapsulation de ce lysate à l’intérieur des vésicules géantes nonilamellar à base de cholestérol (GUV) (c.-à-d. liposomes stables), pour former des cellules synthétiques. Le protocole décrit les méthodes de préparation des composants des cellules synthétiques, y compris la production de lysates bactériens actifs, suivie d’une préparation détaillée étape par étape des cellules synthétiques basée sur une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile. Ceux-ci facilitent la production de millions de cellules synthétiques d’une manière simple et abordable avec une grande polyvalence pour produire différents types de protéines. Les cellules synthétiques obtenues peuvent être utilisées pour étudier la production et l’activité des protéines/ARN dans un environnement isolé, dans une évolution dirigée, et aussi comme une plate-forme contrôlée de livraison de médicaments pour la production à la demande de protéines thérapeutiques à l’intérieur du corps.
Les cellules synthétiques sont des particules artificielles ressemblant à des cellules, imitant une ou plusieurs fonctions d’une cellule vivante, telles que la capacité de diviser, former des interactions membranaires et synthétiser les protéines à partir d’un code génétique1,2,3. Les cellules synthétiques qui enferment les systèmes de synthèse des protéines sans cellules (CFPS) possèdent une modularité élevée en raison de leur capacité à produire diverses protéines et séquences d’ARN suite à des altérations dans le modèle d’ADN. Présentant une alternative attrayante aux approches actuelles de la production de protéines, les systèmes CFPS sont basés sur le lysate cellulaire, les composants purifiés ou les composants synthétiques et comprennent toutes les machines de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines telles que les ribosomes, la polymérase à ARN, les acides aminés et les sources d’énergie (p. ex., 3-phosphoglycerate et triphosphate adénine)4,5,66,7,89.9 L’encapsulation d’un système CFPS à l’intérieur des vésicules lipidiques permet la production simple et efficace de protéines sans dépendre d’une cellule vivante10. En outre, cette plate-forme permet la synthèse des peptides qui peuvent se dégrader à l’intérieur des cellules naturelles, la production de protéines qui sont toxiques pour les cellules vivantes, et de modifier les protéines avec des acides aminés non naturels11,12. Les cellules synthétiques ont été utilisées comme modèle à des fins de recherche sur les composants cellulaires minimaux nécessaires pour permettre la vie cellulaire d’un point de vue évolutif1,13. Les cellules synthétiques ont également été utilisées pour construire et mettre en œuvre le circuit génétique et comme modèles pour l’évolution dirigée14,15,16. D’autres études ont porté sur la capacité des cellules synthétiques à imiter l’activité biologique des cellules naturelles, visant à remplacer les cellules naturelles endommagées, telles que les cellules bêta chez les patients atteints de diabète17. En outre, la capacité de ces CFPS encapsulant des cellules synthétiques à produire une variété de protéines thérapeutiques illustre son potentiel à être incorporé dans l’utilisation clinique18.
Ici, nous décrivons un protocole ascendant à l’échelle de laboratoire(figure 1) pour la production d’ARN et de cellules synthétiques productrices de protéines à partir d’un système CFPS encapsulé dans une vésicule lipidique. Cela montre l’utilisation potentielle de plates-formes cellulaires synthétiques comme nouveaux systèmes de livraison de médicaments pour la production sur place d’un médicament protéique thérapeutique in vivo19. Des études antérieures ont étudié l’optimisation de la réaction du CFPS et des processus de préparation du lysate cellulaire4,8,20. En outre, plusieurs techniques ont été appliquées pour la préparation des liposomes de la taille d’une cellule, telles que les méthodes de stabilisation des gouttelettes microfluidiques et polymères21,22,23, qui diffèrent également dans la composition lipidique des liposomes24,25,26. Dans le protocole présenté, les cellules synthétiques sont produites à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile et le processus d’encapsulation est effectué à basse température (lt;4 ‘C)5,10,24,27,28. Ces conditions douces se sont avérées favorables pour conserver l’intégrité biofonctionnelle des machines moléculaires, à savoir les ribosomes et les protéines27,29,30. La composition lipidique des particules se compose à la fois de cholestérol et de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Le premier se trouve dans toutes les membranes cellulaires des mammifères et est essentiel pour la stabilité, la rigidité et la réduction de la perméabilité de la membrane, et le second imite la composition des phospholipides mammifères11,13. La base moléculaire de transcription et de traduction cellulaire est extraite de la souche BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), qui est transformée avec la polymérase plasmide pAR1219 pour augmenter la polymérase de l’ARN T7 pour augmenter la puissance du SFC et la synthèse des protéines. Ce système a été utilisé pour produire des protéines diagnostiques et thérapeutiques, avec des poids moléculaires allant jusqu’à 66 kDa in vitro et in vivo19,31. Le protocole suivant fournit une méthode simple et efficace pour la production du système cellulaire synthétique, qui peut répondre à un large éventail de questions fondamentales associées à la synthèse des protéines dans la nature et peut également être utilisé pour les applications d’administration de médicaments.
Ce protocole introduit une méthode simple et abordable pour la production de grandes quantités de cellules synthétiques productrices de protéines. Le rendement des cellules actives dépend de l’exécution soigneuse et précise du protocole en mettant l’accent sur plusieurs étapes critiques. Dans la section de préparation lysate de cette méthode, il est essentiel d’atteindre la densité appropriée de bactéries avant la lyse cellulaire pour obtenir une quantité suffisante de protéines dans le lysate bacté…
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été soutenus par ERC-STG-2015-680242.
Les auteurs reconnaissent également le soutien du Technion Integrated Cancer Center (TICC); l’Institut de nanotechnologie Russell Berrie; le Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences and Engineering; le ministère israélien de l’Economie pour une subvention Kamin (52752); le Ministère israélien de la technologie et de l’espace des sciences – Bureau du scientifique en chef (3-11878); la Fondation des sciences israéliennes (1778/13, 1421/17); l’Association israélienne contre le cancer (2015-0116); la Fondation germano-israélienne pour la recherche scientifique et le développement pour une subvention GIF Young (I-2328-1139.10/2012); le programme FP-7 IRG de l’Union européenne pour une subvention d’intégration professionnelle (908049); la subvention du Centre de recherche Phospholipid; une Fondation Rosenblatt pour la recherche sur le cancer, une subvention de la Fondation de la famille Mallat; et la Fondation de la famille Unger. A. Schroeder reconnaît les bourses Alon et Taub. O. Adir reconnaît les bourses Sherman et Gutwirth. G. Chen reconnaît la bourse Sherman. N. Krinsky reconnaît le programme de doctorat pour femmes Ariane de Rothschild de la Fondation Rothschild Caesarea.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |