Summary
يصف هذا البروتوكول الطريقة والمواد والمعدات والخطوات اللازمة لإعداد الحمض النووي الريبي والبروتين يُنتج الخلايا الاصطناعية من أسفل إلى أعلى. تحتوي المقصورة المائية الداخلية للخلايا الاصطناعية على تحلل اتبكي S30 مغلف داخل طبقة ثنائية من الدهون (أي الليبوزومات المستقرة) ، وذلك باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت.
Abstract
نهج التجميع من أسفل إلى أعلى لبناء الخلايا الاصطناعية هو أداة فعالة لعزل والتحقيق في العمليات الخلوية في بيئة تحاكي الخلية. وعلاوة على ذلك، أظهر تطوير أنظمة التعبير الخالية من الخلايا القدرة على إعادة إنتاج البروتين والنسخ وعمليات الترجمة (DNA→RNA→protein) بطريقة خاضعة للرقابة، مما يسخّر البيولوجيا التركيبية. هنا نصف بروتوكول لإعداد نظام التعبير خالية من الخلايا، بما في ذلك إنتاج تحلل البكتيريا قوية وتغليف هذا تحلل داخل الغنية بالدهون الغنية بالدهون الحويصلات يونيلاميلار (GUVs) (أي liposomes مستقرة)، لتشكيل الخلايا الاصطناعية. ويصف البروتوكول طرق إعداد مكونات الخلايا الاصطناعية بما في ذلك إنتاج الخلايا البكتيرية النشطة، يليها إعداد مفصل للخلايا الاصطناعية خطوة بخطوة على أساس طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت. هذه تسهل إنتاج الملايين من الخلايا الاصطناعية بطريقة بسيطة وبأسعار معقولة مع براعة عالية لإنتاج أنواع مختلفة من البروتينات. يمكن استخدام الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها للتحقيق في إنتاج البروتين / الحمض النووي الريبي والنشاط في بيئة معزولة ، في تطور موجه ، وكذلك كمنصة تسليم الأدوية الخاضعة للرقابة لإنتاج البروتينات العلاجية عند الطلب داخل الجسم.
Introduction
الخلايا الاصطناعية هي جزيئات تشبه الخلايا الاصطناعية ، تحاكي وظيفة واحدة أو متعددة للخلية الحية ، مثل القدرة على الانقسام ، وتشكيل تفاعلات الغشاء ، وتوليف البروتينات استنادًا إلى رمز وراثي1،2،3. تمتلك الخلايا الاصطناعية التي تُغلف أنظمة تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) وحدات عالية بسبب قدرتها على إنتاج بروتينات مختلفة وتسلسلات الحمض النووي الريبي بعد التعديلات في قالب الحمض النووي. تقديم بديل جذاب للنهج الحالية لإنتاج البروتين، وتستند أنظمة CFPS على تحلل الخلايا، والمكونات النقية، أو المكونات الاصطناعية وتشمل جميع آلات النسخ والترجمة اللازمة لتخليق البروتين مثل الريبوسوم، البوليميراز الحمض النووي الريبي، الأحماض الأمينية ومصادر الطاقة (على سبيل المثال، 3-phosphoglycerate والغدينين ثلاثي الفوسفات)4،,5،,6،,7،,8،,9. تغليف نظام CFPS داخل الحويصلات الدهنية تمكن من إنتاج بسيط وفعال من البروتينات دون الاعتماد على الخلية الحية10. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا المنبر تخليق الببتيدات التي قد تتحلل داخل الخلايا الطبيعية، وإنتاج البروتينات السامة للخلايا الحية، وتعديل البروتينات مع الأحماض الأمينية غير الطبيعية11،12. وقد استخدمت الخلايا الاصطناعية كنموذج لأغراض البحث التحقيق في الحد الأدنى من مكونات الخلية المطلوبة لتمكين الحياة الخلوية من منظور تطوري1,13. كما استخدمت الخلايا الاصطناعية لبناء وتنفيذ الدائرة الوراثية وكنماذج للتطور الموجه14،15،16. وقد ركزت دراسات أخرى على قدرة الخلايا الاصطناعية على تقليد النشاط البيولوجي للخلايا الطبيعية، تهدف إلى استبدال الخلايا الطبيعية التالفة، مثل خلايا بيتا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري17. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة هذه الخلايا الاصطناعية CFPS تغليف لإنتاج مجموعة متنوعة من البروتينات العلاجية يوضح قدرتها على أن تدمج في الاستخدام السريري18.
هنا نصف بروتوكول المختبر من أسفل إلى أعلى على نطاق(الشكل 1)لإنتاج الحمض النووي الريبي والخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين على أساس نظام CFPS مغلفة في الحويصلات الدهنية. وهذا يدل على الاستخدام المحتمل لمنصات الخلايا الاصطناعية كأنظمة جديدة لتوصيل الأدوية لإنتاج المخدرات البروتينية العلاجية في الجسم الحي19في الموقع. وقد بحثت الدراسات السابقة الأمثل من رد فعل CFPS وعمليات إعداد الخلية lysate4،8،20. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق العديد من التقنيات لإعداد الدهون بحجم الخلية، مثل أساليب تثبيت قطرات الدم الدقيقة والبوليمر21،22،23، والتي تختلف أيضًا في تكوين الدهون الدهنية24،25،26. في البروتوكول المعروض ، يتم إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام طريقة نقل مستحلب الماء في الزيت ويتم عملية التغليف في درجات حرارة منخفضة (<4 °C)5،10،24،27،28. وقد وجد أن هذه الظروف المعتدلة مواتية للاحتفاظ بالسلامة الحيوية الوظيفية للآلات الجزيئية ، وهي الريبوسوم والبروتينات27،29،30. يتكون تكوين الدهون من الجسيمات من كل من الكوليسترول و1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). تم العثور على الأول في جميع أغشية خلايا الثدييات وهو ضروري للاستقرار والصلابة والحد من نفاذية الغشاء ، ويحاكي هذا الأخير تكوين فوسفوليبيد الثدييات11،13. يتم استخراج النسخ الخلوي والآلات الجزيئية الترجمة من سلالة BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) ، والتي يتم تحويلها مع pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase لزيادة قوة CFPS وتخليق البروتين. وقد استخدم هذا النظام لإنتاج البروتينات التشخيصية والعلاجية، مع الأوزان الجزيئية تصل إلى 66 كيلو في المختبر وفي الجسم الحي19،,31. يوفر البروتوكول التالي طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج نظام الخلايا الاصطناعية ، والتي يمكن أن تعالج مجموعة واسعة من الأسئلة الأساسية المرتبطة بتخليق البروتين في الطبيعة ويمكن استخدامها أيضًا في تطبيقات تسليم الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتم تقديم توضيح بروتوكول إنتاج الخلايا الاصطناعية الكاملة في الشكل 1. وفقا لاحتياجات المستخدم، يمكن أيضا أن يتم التعبير البروتين (القسم 3.2) وتشكيل الخلايا الاصطناعية (القسم 4) أجزاء من البروتوكول بشكل مستقل (مع بعض التعديلات).
1. إعداد S30-T7 lysate
- لوحة متتالية والقولونية BL21 (DE3) البكتيريا التي تحولت مع T7 RNA polymerase التعبير عن pAR1219 plasmid على لوحة LB-agar تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين للحصول على مستعمرات واحدة.
- إعداد حل بداية: Inoculate مستعمرة واحدة إلى 5 مل من LB-media تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة إرلينماير 100 مل وتنمو بين عشية وضحاها باستخدام شاكر حاضنة الكلمة في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. إعداد التكرارات.
- Inoculate كل 5 مل بداية بشكل منفصل في 500 مل من وسائل الإعلام السل تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين في قارورة 2 لتر Erlenmeyer مع يحير وتنمو باستخدام شاكر حاضنة الكلمة في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى تصل OD600 من 0.8-1. مراقبة دوري باستخدام مطياف.
- إضافة 2-3 مل من 100 mM مخزون IPTG (للوصول إلى 0.4 - 0.6 mM) لتحريض T7 RNA polymerase التعبير والاستمرار في زراعة الثقافة حتى تصل إلى OD600☆4.
- نقل المحلول من كل قارورة إرلنماير إلى أنبوبين معقمين من نوع 250 مل.
- الطرد المركزي لكل من7000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين بيليه البكتيري ة عند -20 درجة مئوية لبضعة أيام قبل الانتقال إلى الخطوات التالية. - إعادة تعليق كل بيليه في 250 مل من الباردة (4 درجات مئوية) S30 lysate عازلة والطرد المركزي في 7000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت S30 lysate للحفاظ على استقرار البروتين بعد إجراء تحليل الخلايا باستخدام المتجانس في الخطوة 1.9. ومن هذه الخطوة إلى الأمام، ينبغي تنفيذ جميع الخطوات حتى 1.12 على التوالي وبسرعة.
ملاحظة: قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تبريد النصائح وقوارير 1.5 ملليلتر قبل الانتقال إلى الخطوة التالية التي ستكون ضرورية لتخزين الليسات - تجاهل supernatant وإعادة تعليق جميع الكريات معا في 15 مل من الباردة S30 lysate المخزن المؤقت. تصفية التعليق باستخدام وسادة الشاش.
ملاحظة: 15ml من الحل يرجع إلى حجم المتجانس دقيقة. وينبغي أن يلاحظ أن تركيز البكتيريا مهم أيضا. - التجانس عند ضغط عمل قدره 15,000 psi ، مع ضغط هواء من 4 بار (تمريرتين) لكسر الخلايا. تجنب تخفيف المحلول لزيادة التركيز والفعالية.
- إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 M DTT (تنبيه) لكل 10 مل من التعليق المتجانس.
- طرد مركزي التعليق عند 24,700 × ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تنفيذ الخطوة التالية بسرعة للحفاظ على نشاط lysate: تقسيم supernatant واحدا تلو الآخر إلى 200 μL aliquots في قارورة 1.5 مل تبريد مسبق وفورا المفاجئة تجميدها مع النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.
تنبيه: يتم تصنيف DTT على أنها مهيجة وضارة وبالتالي يجب التعامل معها بعناية.
2. إعداد الدهون في محلول الزيت
- إذابة POPC والكوليسترول في الكلوروفورم (تنبيه) بشكل منفصل ، كل إلى تركيز نهائي قدره 100 ملغ / مل. دوامة كل قارورة على حدة.
- الجمع بين المكونات في قارورة زجاجية 2mL: إضافة 50 ميكرولتر من POPC في الكلوروفورم، 50 ميكرولتر من الكوليسترول في الكلوروفورم و 500 ميكرولتر من الزيوت المعدنية. وبالنسبة لـ 100 ميكرولتر من الخلايا الاصطناعية، يلزم وجود قنينتين من الدهون في الزيت.
- دوامة، ثم الحرارة لحوالي 1 ساعة في 80 درجة مئوية في غطاء محرك السيارة الكيميائية لتبخر الكلوروفورم. تأكد من حدوث التبخر الكامل باتباع الوقت / الشروط المحددة ومراقبة حجم الحل.
ملاحظة: يمكن تخزين محلول الدهون في الزيت الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين. لتحسين النتائج، فمن المستحسن استخدام إعداد جديد قبل كل تجربة. يمكن تغيير نسب الدهون والكوليسترول وفقا لتكوين الغشاء المطلوب. تركيز عالية من الكوليسترول يمكن أن يؤدي إلى تشكيل المجاميع في حل الخلية الاصطناعية النهائية.
تنبيه: يتم تصنيف الكلوروفورم على أنه مهيج وضار وبالتالي يجب علاجه بعناية وفي المناطق التي يتم استخراج الأبخرة فيها.
3. الاستعدادات من الحلول الخارجية، ما قبل الداخلية والتغذية
- إعداد حلول الأسهم
- إعداد حلول الأسهم المدرجة في الجدول 2 باستخدام المياه فائقة النقاء (UPW).
ملاحظة: يجب إعداد حلول المخزون مسبقًا وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي. الكاشف 7 يميل إلى تشكيل المجاميع. التدفئة إلى 37 درجة مئوية سوف تقلل من التجميع. لن يؤثر التجميع الطفيف على رد الفعل بشكل كبير. محلول كاشف 8 هو حليبي وتعكر.
- إعداد حلول الأسهم المدرجة في الجدول 2 باستخدام المياه فائقة النقاء (UPW).
- الحل الخارجي
- حل الجلوكوز في DNase / RNase خالية H2O إلى تركيز نهائي من 200 mM.
- ل100 ميكرولتر من المحلول الداخلي، قم بإعداد 1.6 مل من المحلول الخارجي.
- حل ما قبل الداخلية
- إضافة الكواشف 1-14 وفقا للكميات والتركيز المذكورة في الجدول 2. على سبيل المثال، بالنسبة لحجم الخلية الاصطناعية النهائي البالغ 100 ميكرولتر، قم بإعداد 100 ميكرولتر من المحلول الداخلي.
ملاحظة: يجب إضافة UPW لإكمال وحدة التخزين المطلوبة النهائية. في هذه المرحلة، يمكن تخزين الخليط في 4 درجة مئوية لبضع ساعات.
- إضافة الكواشف 1-14 وفقا للكميات والتركيز المذكورة في الجدول 2. على سبيل المثال، بالنسبة لحجم الخلية الاصطناعية النهائي البالغ 100 ميكرولتر، قم بإعداد 100 ميكرولتر من المحلول الداخلي.
- محلول التغذية
- إضافة جميع الكواشف وفقا للكميات والتركيز المدرجة في الجدول 3.
ملاحظة: استخدام نسبة 1:1 من محلول التغذية: الحل الداخلي. لحجم الخلية الاصطناعية النهائي من 100 ميكرولتر، وإعداد 100 ميكرولتر من محلول التغذية. فمن المستحسن لإعداد حجم زائد صغير من الخارجي والداخلي والتغذية الحل.
- إضافة جميع الكواشف وفقا للكميات والتركيز المدرجة في الجدول 3.
4- إعداد الخلايا الاصطناعية
ملاحظة: يتم تعديل المجلدات التالية لإعداد 100 ميكرولتر من الخلايا الاصطناعية.
- الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين
- في أنبوب 15 مل، ضع 12 مل من الحل الخارجي وأضف ببطء، على أعلى طبقة، 500 ميكرولتر من الدهون في محلول الزيت. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- لوضع اللمسات الأخيرة على إعداد الحل الداخلي: اخلطي مكونات الحل الداخلي على الجليد المطحون إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر عن طريق إذابة وإضافة S30-T7 Lysate (كاشف 15) والحمض النووي البلازميد (كاشف 16) إلى الخليط المخزن.
- إلى الثانية 2 مل قارورة زجاجية مع 500 ميكرولتر من الدهون في محلول النفط، إضافة 100 ميكرولتر من الحل الداخلي. بيزيت صعودا وهبوطا بقوة لمدة 1 دقيقة ودوامة لمدة دقيقة أخرى على المستوى الخامس.
- الاحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد المسحوق وإضافة ببطء المستحلب الناتج على رأس مرحلة النفط في أنبوب 15 مل (من 4.1.1).
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 100 × غرام و 4 درجات مئوية ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 400 × غرام و 4 درجات مئوية. بحلول نهاية الطرد المركزي ، يجب ملاحظة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
ملاحظة: يُفضل استخدام دوار الطرد المركزي المتأرجح للدلو هنا للحصول على تغطية أفضل لطبقة ثانية من الدهون أثناء مرور قطرات الماء في الزيت عبر الطور البيني. في حالة عدم وجود بيليه ملحوظ ، يمكن زيادة سرعة الطرد المركزي إلى 1000 × ز. وإلا، راجع قسم المناقشة الذي يشير إلى الخطورة المحددة للحل الخارجي. - استخراج بيليه.
- إزالة طبقة الزيت الزائدة.
- استخدم طرف ماصة مشذب محملًا بما يقرب من 400 ميكرولتر من المحلول الخارجي لاستخراج البيليه. الافراج عن الحل الخارجي أثناء مرورها من خلال مرحلة النفط من أجل جمع فقط بيليه في المرحلة المائية.
- مسح الطرف بعد استخراج بيليه لتجنب نقل بقايا النفط ونقل بيليه إلى أنبوب 1.5 مل نظيفة.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة عند 1000 × ز و 4 درجات مئوية ، قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من محلول التغذية (نسبة 1:1 من حلول التغذية الداخلية).
ملاحظة: يمكن استخدام دوار طرد مركزي بزاوية ثابتة هنا أيضًا. - للتعبير عن البروتين، واحتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
ملاحظة: يختلف وقت الحضانة الأمثل بين البروتينات المختلفة. - تقييم كمية البروتين المنتجة باستخدام طريقة مناسبة وفقا لخصائص البروتين المستهدفة.
- مجموعات التحكم الموصى بها
- الحل الداخلي وتأكيد النشاط المنحل
- إعداد حل داخلي كامل (مع الحمض النووي وS30-T7 lysate).
- احتضان رد الفعل أعلاه على الفور باستخدام شاكر حاضنة الكلمة في 250 دورة في الدقيقة أو ثيرمالخلاط في 1200 دورة في الدقيقة، في درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: ضبط وقت الحضانة لتتناسب مع وقت حضانة الخلايا الاصطناعية.
- الخلايا الاصطناعية
- مجموعة التحكم السلبي: قم بإعداد البروتوكول المقدم في 4.1 مع الحل الداخلي بدون الحمض النووي.
- التحكم الإيجابي: قم بإعداد البروتوكول المقدم في 4.1 مع حل داخلي يحتوي على ترميز بلازميد T7 لجين مراسل.
ملاحظة: أضف مجموعة تحكم إيجابية تتكون من جين مراسل، مثل sfGFP، إلى جانب مجموعات الاختبار لضمان خطوة كفاءة التغليف.
- الحل الداخلي وتأكيد النشاط المنحل
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن نقدم بروتوكوللإعداد الخلايا الاصطناعية عن طريق تغليف نظام S30-T7 CFPS على أساس BL21 E. القولونية داخل الحويصلات الدهنية. ويرد في الشكل 2وصف تخطيطي لعملية الإعداد يتضمن صورة لكل مرحلة . يعتمد نجاح عملية إعداد الخلايا الاصطناعية على الأداء المناسب لكل مرحلة ويتأثر بمعلمات مختلفة. وينبغي تعديل البروتوكول لاستيعاب إنتاج بروتين معين.
تم إدخال Plasmids التعبير عن نموذج البروتين فائقة المجلد البروتين الفلورسنت الأخضر (sfGFP) ورينيلا Luciferase تحت T7 المروج في تفاعلات CFPS السائبة والخلايا الاصطناعية، وتم تقييم إنتاج البروتين باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك لطخة الغربية، قياس الخلايا التدفق، المجهر والتحليل الطيفي(الشكل 3). يتم تقديم التحقق من sfGFP-له6 البروتين الموسومة (~ 27 kDa32)الإنتاج من قبل تحليل لطخة الغربية في الشكل 3A. تم خلط عينة من 30 ميكرولتر من الخلايا الاصطناعية المخففة 6 طيات مع 10 ميكرولتر من العازلة عينة SDS-PAGE المشتركة (التي تحتوي على المنظفات كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) وα-mercaptoethanol) والمغلي لمدة 10 دقيقة (95 درجة مئوية). وجدنا أن الجمع بين الحرارة والمنظفات في العازلة عينة كافية لتفكيك الحويصلات وتمكين تشغيل البروتينات في هلام SDS-PAGE. تم إجراء الكشف عن البروتين باستخدام الأجسام المضادة الأولية المضادة لمضادات البوليكلون (المخفف 1:12,000). وكما هو متوقع، في حين يتم الكشف عن إنتاج البروتين في عينات تحتوي على قوالب الحمض النووي ترميز sfGFP ("+sfGFP DNA")، لا يلاحظ أي بروتين في عينات التحكم السلبي التي تم فيها استبعاد قالب الحمض النووي ("-DNA"). وتستخدم عينات من sfGFP تنقية وsfGFP المنقى مغلفة داخل غشاء الخلايا الاصطناعية (sfGFP (مغلفة))، كضوابط إيجابية لإنتاج sfGFP CFPS السائبة وتوليفها داخل الخلايا الاصطناعية، respectivley. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع مختلفة من البروتين. وفقا لKrinsky وآخرون19، والعائد من إنتاج sfGFP التي تم الحصول عليها بموجب بروتوكول مفصل هو 380 ميكروغرام / مل في محلول CFPS و 5.3 ميكروغرام / مل ، عندما يتم تغليف محلول CFPS داخل الحويصلات الدهنية.
عندما يكون البروتين الذي يتم إنتاجه داخل الخلايا الاصطناعية فلوريًا ، يمكن تقييم إنتاجه باستخدام الأساليب المستندة إلى القياس المجهري والتدفق. قمنا بتحليل الخلايا الاصطناعية باستخدام مجهر الفلورسنت مع مرشح لفلورسينG(الشكل 3B). نظرًا لأن مكونات CFPS تحتوي على بعض الفلورسنت ، يجب تكييف معلمات اكتساب الصور وفقًا لعينة التحكم السلبي المناسبة (الخلايا الاصطناعية التي لا تحتوي على قالب الحمض النووي ، على سبيل المثال).
وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تدفق قياس الخلايا الخلوي لتحديد متوسط كثافة الفلورسان من الخلايا الاصطناعية المنتجة sfGFP، والنسبة المئوية للخلايا الاصطناعية النشطة، والتي يمكن أن تنتج البروتينات داخلها(الشكل 3C I & II). تم جمع 10,000 حدث لكل عينة تم تحليلها. إنتاج الخلايا الاصطناعية، الذي هو موضح في هذا البروتوكول، وعادة ما ينتج عدد نشط من السكان من 21-25٪ داخل حل مع تركيز تقريبي من 107 خلايا اصطناعية / مل. شدة الفلورسين طفيف ة التي تقدمها عينات "الحمض النووي" في الشكل 3C الثاني ويرجع ذلك إلى الفلورات من مكونات مختلفة في رد فعل CFPS مثل S30 lysate.
ويبين تحليل الحجم التمثيلي استناداً إلى إشارة GFP (في القطر) للخلايا الاصطناعية التي أعدتها الطريقة المذكورة أعلاه متوسط قيمة 2.4 ± 0.5 ميكرومتر(الشكل 3D II). كما تشكيل المياه في مستحلب النفط في هذه الطريقة هو نتيجة لتطبيق القوى الميكانيكية، وتوزيع حجم الجسيمات قد تتأثر بعوامل مختلفة، مثل طريقة وسرعة pipetting مستحلب صعودا وهبوطا، ونموذج آلة خلاط دوامة، الخ.
لاختبار براعة إنتاج البروتين الخلايا الاصطناعية، تم تحليل التعبير عن البروتين مراسل رينيلا لوسيفيراز داخل الخلايا الاصطناعية(الشكل 3E). قياس كمية رينيلا luciferase النشاط عن طريق قياس الإنارة الناتجة عن رد فعل الأنزيمية من لوسيفيراز وركائزها، h-coelenterazine. وللحث على التفاعل الأنزيمي، أضيف تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر من h-coelenterazine إلى الخلايا الاصطناعية (25 ميكرولتر حجم العينة) قبل القياس. تم استخدام عينة "-DNA"، التي لا تحتوي على قالب الحمض النووي ترميز لوسيزاز كتحكم سلبي لاختبار الإنارة بسبب الأكسدة غير الأنزيمية للركيزة. تم قياس الإضاءة باستخدام قارئ لوحة.
الشكل 1: توضيح لعملية بروتوكول إعداد الخلايا الاصطناعية النموذجية. وتنقسم العملية إلى خطوتين. الخطوة 1: الاستعدادات قبل التجربة بما في ذلك تنقية الحمض النووي البلازميد، S30-T7 إعداد lysate، إعداد حلول المخزون المطلوبة للحلول الداخلية والتغذية، وإعداد محلول الدهون في النفط وإعداد الحل الخارجي. الخطوة 2: تشكيل الخلايا الاصطناعية التي تشمل التغذية وإعداد الحلول الداخلية، وإعداد الخلايا الاصطناعية والتحليل. مثال على الحجم المطلوب من كل مكون لإعداد 100 ميكرولتر من محلول الخلايا الاصطناعية هو عرض باللون الأزرق بين قوسين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لبروتوكول إعداد الخلايا الاصطناعية. توضح صورة عملية جيدة الأداء كل مرحلة من مراحل البروتوكول. وقد تم تعديل هذا الرقم من Krinsky وآخرون19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية لإنتاج sfGFP ورينيلا لوسيبريز داخل الخلايا الاصطناعية. (أ)تحليل لطخة الغربية من إنتاج sfGFP-His6 في كل من ردود الفعل السائبة CFPS وداخل الخلايا الاصطناعية. تم الكشف عن البروتين باستخدام الأجسام المضادة الأولية المضادة لمضادات البوليكلون (المخفف 1:12,000). تم استخدام sfGFP-His6 المنقى كتحكم إيجابي (7.8 ميكروغرام). sfGFP (مغلفة) هو السيطرة الإيجابية من sfGFP تنقية مغلفة في الخلايا الاصطناعية. واستخدمت العينات التي لا توجد بها قوالب الحمض النووي كتحكم سلبي في تحليل الإنتاج ("-DNA"). (ب)صور تمثيلية لخلايا اصطناعية تنتج sfGFP تم التقاطها باستخدام مجهر فلوري مع حقل مشرق وفلتر GFP. أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر(C)I & II تحليل قياس الخلايا التدفق من sfGFP إنتاج نشاط الخلايا الاصطناعية (البيانات التي تم جمعها باستخدام الرقمية، 4 ليزر محلل). تم قياس العينات بعد 3 ح من الحضانة. تم جمع 10,000 حدث لكل عينة تم تحليلها. واستُخدمت مرشحات FSC (500 V) وSSC (300 V) لتحديد إجمالي عدد الخلايا الاصطناعية. ثم تم استخدام فلتر FITC (600 V) للكشف عن فلورية GFP.. (I) حساب مجموعة الخلايا الاصطناعية النشطة [%] كان يستند إلى عتبة كثافة الفلورسان GFP، التي تم تعريفها بواسطة عينة "-DNA" (الرسم البياني الأحمر)، مما يسمح بخطأ قدره 1٪ ~ 1٪. '2' تعني شدة الفلورسية للخلايا الاصطناعية المنتجة لـ sfGFP. تم حساب هذه القيمة من مجموعة الخلايا الاصطناعية النشطة وتطبيعها إلى عينة "الحمض النووي" عن طريق تقسيم الفلورسية المتوسطة للخلايا الاصطناعية النشطة على متوسط الخلايا الاصطناعية دون الحمض النووي sfGFP. (D)I & II تحليل حجم الخلية الاصطناعية. تم الكشف عن طيف الانبعاثات من قبل 505-560 نانومتر و 642-745 نانومتر لGFP وإشارات المجال الساطع، على التوالي. (ط) صورة تمثيلية للخلايا الاصطناعية التي تم تحليلها. '2' توزيع حجم الخلايا الاصطناعية. تم إجراء التحليل وتم حساب التوزيعات القطرية للخلايا الاصطناعية النشطة على أساس إشارة GFP. (E)إنتاج رينيلا لوسيراز النشط داخل الخلايا الاصطناعية. تم قياس نشاط لوسيفراز بقياسات التلألوئ بعد إضافة 1 ميكرومتر h-coelenterazine باستخدام قارئ لوحة وقدم على أنه شدة الضوء [RLU] x 106. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجدول 1: إعداد حلول المخازن المؤقتة والمخزون. | |
| تعليقات | |
| لوريا برداني (LB) أجار (1.5%) لوحه: | إعداد وتعقيم. إضافة الأمبيسيلين بتركيز نهائي من 50 ميكروغرام / مل فقط بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة. |
| 10 غ/لتر باكتو تريبتون | |
| 10 غ/لتر كلوريد الصوديوم (NaCl) | |
| 5 غ/لتر استخراج الباكتو-خميرة | |
| 15 غ/لتر أغار أغار تنقية | |
| 50 ميكروغرام/مل أمبسيسيلين | |
| LB وسائل الإعلام (20 مل): | الحد الأدنى من وسائل الإعلام. إعداد وتعقيم مقدما. قبل تلقيح البكتيريا، أضف الأمبيسيلين بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل. |
| 10 غ/لتر باكتو تريبتون | |
| 10 غ/لتر كلوريد الصوديوم (NaCl) | |
| 5 غ/لتر استخراج الباكتو-خميرة | |
| 50 ميكروغرام/مل أمبسيسيلين | |
| رائع مرق (السل) وسائل الإعلام (1 L): | وسائل الإعلام الغنية. إعداد وتعقيم مقدما. قبل تلقيح البكتيريا، أضف الأمبيسيلين بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام/مل. |
| 12 غ/لتر باكتو تريبتون | |
| 24 غ/لتر استخراج باكتو-خميرة | |
| 4% (v/v) الليسترول اللامائي | |
| 2.32 غ/لتر K2HPO4 | |
| 12.54 غ/لتر KH2PO4 | |
| 50 ميكروغرام/مل أمبسيسيلين | |
| S30 lysate المخزن المؤقت (1.5 لتر): | إعداد وتعقيم مقدما (* باستثناء DTT و 2-mercaptoethanol). تخزين في -4 درجة مئوية. |
| 10 mM تريس خلات في درجة الحموضة = 7.4 | قاعدة تريسما. إعداد وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام حمض الخليك. |
| خلات ماغنسيوم بـ 14 مل | |
| خلات البوتاسيوم بـ 60 متر متر | |
| * 1 mM DTT | إضافة قبل الاستخدام |
| *0.5 مل/لتر 2-mercaptoethanol | إضافة قبل الاستخدام |
| 1 M HEPES-KOH (درجة الحموضة = 8): | حل HEPES إلى تركيز نهائي من 1 M. ضبط لدرجة الحموضة 8 باستخدام محلول KOH. |
| HEPES | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) | |
| الجدول 2: تكوين الحل الداخلي. | ||||||||||
| وحدة تخزين الحل الداخلي المطلوبة نهائيًا | ||||||||||
| عدد | كاشف | مخزون conc. | الـ(كون) النهائي | 25 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر | 300 ميكرولتر | 400 ميكرو ل | |
| 1 | HEPES KOH pH =8 | 1 متر | 55 متر متر متر | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | حل ما قبل الداخلية |
| 2 | خلات المغنيسيوم | 1 متر | 14 متر متر | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | خلات البوتاسيوم | 1 متر | 50 متر متر | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | خلات الأمونيوم | 5.2 متر | 155 متر متر متر | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3-PGA | 0.5 متر | 40 متر متر | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | الأحماض الأمينية - خليط أنا | 50 متر | 2.5 متر متر | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | الأحماض الأمينية - خليط الثاني | 50 متر | 2.5 متر متر | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 متر متر | 1.2 متر متر | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | GTP | 50 متر متر | 1 متر متر | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 متر متر | 0.8 متر متر | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG | 100 متر متر | 1 متر متر | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | السكروز | 2 متر | 200 متر متر مربع | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | الحمض النووي البلازميد | 10 ميكروغرام/مل | * | * | * | * | * | * | ||
| الجدول 3: تغذية تكوين الحل. | |||||||||
| حجم محلول التغذية المطلوب النهائي | |||||||||
| عدد | كاشف | conc الأسهم. | conc النهائي. | 25 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر | 300 ميكرولتر | 400 ميكرولتر |
| 1 | HEPES KOH pH =8 | 1 متر | 83.3 متر متر | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | خلات المغنيسيوم | 1 متر | 21.2 متر مربع | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | خلات البوتاسيوم | 1 متر | 75.5 متر متر | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | خلات الأمونيوم | 5.2 متر | 236.4 متر مربع | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3-PGA | 0.5 متر | 60.1 متر متر | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | الأحماض الأمينية - خليط أنا | 50 متر متر | 3.8 متر متر | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | الأحماض الأمينية - خليط الثاني | 50 متر متر | 3.8 متر متر | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 متر متر | 1.8 متر متر | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | GTP | 50 متر متر | 1.5 متر متر | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 متر متر | 1.2 متر متر | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG | 100 متر متر | 1.5 متر متر | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | الجلوكوز | 2 متر | 200 متر متر مربع | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| الجدول 4: الحلول المطلوبة لإعداد الخلايا الاصطناعية. | |
| الحل والمواد المطلوبة | تعليقات |
| الدهون في الزيت | تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. أعدت وفقا للقسم 2 |
| الحل الخارجي | أعدت وفقا للقسم 3.1 |
| الحل الداخلي | أعدت وفقا للقسم 3.2. |
| إعداد الاختبارات + عينات الضوابط وفقا للقسم 4.1. | |
| الحفاظ على الجليد المسحوق حتى الاستخدام. | |
| محلول التغذية | أعدت وفقا للقسم 3.3. |
| الحفاظ على الجليد المسحوق حتى الاستخدام. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة وبأسعار معقولة لإنتاج كميات كبيرة من الخلايا الاصطناعية المنتجة للبروتين. تعتمد غلة الخلايا النشطة على التنفيذ الدقيق والدقيق للبروتوكول مع التركيز على العديد من الخطوات الحاسمة. في قسم إعداد الليكل من هذه الطريقة ، من الضروري الوصول إلى كثافة البكتيريا المناسبة قبل تحليل الخلايا لتحقيق كمية كافية من البروتينات في الانزلات البكتيري. ثانيا، يجب أن يتم إجراء عملية الانزل عند 4 درجة مئوية وتجمد الليسات بسرعة مع النيتروجين السائل للحفاظ على نشاط البروتين. وعلاوة على ذلك، في هذا البروتوكول استخدمنا E. القولونية BL21 (DE3) الخلايا التي تحولت مع pAR1219 plasmid التعبير عن T7 RNA بولميراز. في الحالات التي يتم فيها استخدام سلالة مختلفة من البكتيريا ، قد تكون هناك حاجة إلى تغييرات في تركيز تحلل الخلايا للوصول إلى كمية مرضية من البوليميراز الحمض النووي الريبي والريبوسوم. حتى عندما يتم استخدام نفس السلالة البكتيرية، قد يكون إنتاجات مختلفة من الانضلم بعض التقلبات دفعة إلى دفعة.
يتضمن قسم إنتاج الحويصلات أيضًا بضع خطوات هامة. إن إزالة الدهون وإزالة الكلوروفورم من الزيت المعدني أمر مهم لإنشاء مستحلب الماء في الزيت. والطرد المركزي للقطرات المائية في الزيت في الحاجز المائي الخارجي هو أيضا خطوة رئيسية في البروتوكول لتوليد خلايا اصطناعية ذات طبقة ثنائية من الدهون. قد تؤدي التغيرات في الحل الداخلي للحوائق وتكوين الدهون إلى طبقة من القطرات في مرحلة ما بين المياه النفطية دون أي بيليه يمكن ملاحظته. للتغلب على هذا، حل سريع هو زيادة سرعة الطرد المركزي إلى 1000 × ز في خطوة نقل مستحلب. وفي حالة عدم حل هذه المسألة، يمكن تغيير الخطورة المحددة للحل المائية الخارجية لضمان أن يكون للحل الداخلي خطورة محددة أعلى من المحلول الخارجي. وعلاوة على ذلك، قد تختلف التنازولية من الحل الداخلي أيضا بين مصادر مختلفة والانتاج، تتراوح بين 800-1100 mOsm/kg. إن التغير في السُمَج في المحلول الداخلي يرجع في الغالب إلى تغير تركيزات المحلول الليسي خلال عملية إنتاجه. عادة لا يؤدي هذا إلى تغييرات كبيرة في إنتاج البروتين ، ومع ذلك قد يؤدي تخفيف كبير إلى انخفاض العائد بسبب انخفاض تركيزات إنزيمات النسخ والترجمة في الانزيمات نفسها. قياس إجمالي تركيز البروتين في كل دفعة حلس يمكن أن تساعد في ضبط تركيزات حل الليفية في الحل الداخلي للحفاظ على القيم الثابتة (ما يقرب من 22 ملغ / مل تقاس بالفحص برادفورد).
ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها بعض القيود التي ينبغي ذكرها. ليست كل الخلايا الاصطناعية المتولدة نشطة وقادرة على إنتاج البروتينات بسبب التغليف غير الكامل لجميع المكونات المطلوبة. قمنا بقياس ما يقرب من 21-25٪ من الخلايا النشطة عند إنتاج sfGFP المعبرة عن الخلايا الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي (لم يتم ملاحظة اختلافات كبيرة في الحجم بين الخلايا النشطة وغير النشطة). تبقى بقايا الزيت والدهون الزائدة في بعض الأحيان في غشاء الدهون الثنائي ة بعد نقل الخلايا الاصطناعية إلى المرحلة المائية. تحسين تركيزات الدهون والكوليسترول في مرحلة النفط يمكن أن يحسن هذه المسألة. ومن المهم أيضا ملاحظة أن توزيع حجم الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها واسع جدا بالمقارنة مع الأساليب الدقيقة الدقيقة البديلة، مع الحويصلات التي تتراوح بين 1-50 ميكرومتر تقريبا.
العائد العالي لطريقة نقل المستحلب يجعلها مناسبة خاصة للخلايا الاصطناعية تغليف أنظمة تخليق البروتين خالية من الخلايا لإنتاج البروتين العلاجي. وقد استخدمت اختلافات مختلفة من طريقة نقل مستحلب في دراسات الخلايا الاصطناعية وشملت التغييرات في إجراء إعداد النفط، وتكوين الغشاء،5وحجم العينة، والحل الداخلي لنسبة النفط وسرعات الطرد المركزي5،24،,28. كما استخدمت أساليب تثبيت قطرات microfluidic والبوليمر القائم لإعداد الخلايا الاصطناعية، ومع ذلك، لم يتم تنفيذ تغليف نظام CFPS كله حتى الآن مع هذه الأساليب21،22،23.
الخلايا الاصطناعية التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة أظهرت في الجسم الحي لإنتاج البروتينات وعلاج السرطان في نماذج المورين19. يمكن توسيع قدرات هذه الخلايا في المستقبل إلى ما وراء التعبير البروتيني. وقد وصفت مؤخرا التكامل بين العمليات الخلوية الأخرى مثل الاتصالات الخلوية، وتعديل الهيكل الخلوي وتقسيم الخلية في الخلايا الاصطناعية33،34،35،36. استبدال المحلول البكتيري مع الليكاريوتيك الخلية lysate سوف تسمح التعبير عن البروتينات مع تعقيد أعلى وتعديلات ما بعد الترجمة، وربما سيكون أقل مناعة حتى من دون إجراء التنظيف، وبالتالي فتح المزيد من الحدود العلاجية37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل ERC-STG-2015-680242.
ويعترف المؤلفون أيضا بدعم مركز تكنيون المتكامل للسرطان( TICC)؛ معهد راسل بيري للتكنولوجيا النانوية؛ مركز لوري لوكي متعدد التخصصات لعلوم الحياة والهندسة؛ وزارة الاقتصاد الإسرائيلية لمنحة كامين (52752)؛ وزارة تكنولوجيا العلوم والفضاء الإسرائيلية - مكتب كبير العلماء (3-11878)؛ المؤسسة الإسرائيلية للعلوم (1778/13، 1421/17)؛ الجمعية الإسرائيلية للسرطان (2015-0116)؛ المؤسسة الألمانية الإسرائيلية للبحث العلمي والتطوير من أجل منحة من شركة GIF Young (I-2328-1139.10/2012)؛ برنامج الاتحاد الأوروبي FP-7 IRG لمنحة الاندماج الوظيفي (908049)؛ منحة مركز أبحاث فوسفوليبيد؛ (أ) مؤسسة روزنبلات لبحوث السرطان، منحة مؤسسة الأسرة في مالات؛ ومؤسسة عائلة (أونغر) أ. شرودر يعترف زمالتي ألون وتاوب. O. Adir يعترف زمالات شيرمان وغوتويرث. ز. تشين يعترف زمالة شيرمان. ن. كرينسكي يعترف البارونة أريان دي روتشيلد برنامج الدكتوراه النسائية من مؤسسة روتشيلد قيصرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W.
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C.
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H.
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
