Denne protokollen beskriver metoden, materialer, utstyr og trinn for nedenfra og opp forberedelse av RNA og proteinproduserende syntetiske celler. Det indre akdige rommet i de syntetiske cellene inneholdt S30 bakteriell lysat innkapslet i en lipid bilayer (dvs. stabile liposomer), ved hjelp av en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode.
Nedenfra og opp montering tilnærming for bygging av syntetiske celler er et effektivt verktøy for å isolere og undersøke cellulære prosesser i en celle etterligne miljø. Videre har utviklingen av cellefrie uttrykkssystemer vist evnen til å rekonstituere proteinproduksjon, transkripsjon og oversettelsesprosesser (DNA→ RNA→protein) på en kontrollert måte, og utnytte syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokoll for å forberede et cellefritt uttrykkssystem, inkludert produksjon av en potent bakteriell lysat og innkapsling av denne lysaten inne i kolesterolrike lipidbaserte, unilamellære vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), for å danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metodene for å forberede komponentene i de syntetiske cellene, inkludert produksjon av aktive bakterielle lysater, etterfulgt av en detaljert trinnvis forberedelse av syntetiske celler basert på en vann-i-olje emulsjon overføringsmetode. Disse letter produksjonen av millioner av syntetiske celler på en enkel og rimelig måte med høy allsidighet for å produsere forskjellige typer proteiner. De oppnådde syntetiske cellene kan brukes til å undersøke protein/RNA-produksjon og aktivitet i et isolert miljø, i rettet evolusjon, og også som en kontrollert legemiddelleveringsplattform for behovsbetinget produksjon av terapeutiske proteiner inne i kroppen.
Syntetiske celler er kunstige cellelignende partikler, etterligner en eller flere funksjoner i en levende celle, for eksempel evnen til å dele, danne membraninteraksjoner og syntetisere proteiner basert på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler som omslutter cellefrie proteinsyntese (CFPS)-systemer har høy modularitet på grunn av deres evne til å produsere ulike proteiner og RNA-sekvenser etter endringer i DNA-malen. Ved å presentere et attraktivt alternativ til de nåværende tilnærmingene til proteinproduksjon, er CFPS-systemer basert på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og inkluderer alle transkripsjons- og oversettelsesmaskiner som kreves for proteinsyntese som ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-fosforlykemat og adenintriphosfat)4,5,6,7,8,9. Innkapslingen av et CFPS-system inne i lipidvesikler muliggjør enkel og effektiv produksjon av proteiner uten å være avhengig av en levende celle10. Videre tillater denne plattformen syntese av peptider som kan forringes inne i naturlige celler, produksjon av proteiner som er giftige for levende celler, og endre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler har blitt brukt som en modell for forskningsformål som undersøker de minimale cellekomponentene som kreves for å muliggjøre cellulær liv fra et evolusjonært perspektiv1,13. Syntetiske celler har også blitt brukt til å bygge og implementere genetisk krets og som modeller for rettet evolusjon14,15,16. Andre studier har fokusert på evnen til syntetiske celler for å etterligne den biologiske aktiviteten til naturlige celler, med sikte på å erstatte skadede naturlige celler, for eksempel betaceller hos pasienter med diabetes17. Videre illustrerer evnen til disse CFPS-innkapslingssyntetiske cellene til å produsere en rekke terapeutiske proteiner sitt potensial til å bli innlemmet i klinisk bruk18.
Her beskriver vi en bunn-opp lab-skala protokoll (Figur 1) for produksjon av RNA og proteinproduserende syntetiske celler basert på et CFPS-system innkapslet i en lipid vesikkel. Dette viser den potensielle bruken av syntetiske celleplattformer som nye legemiddelleveringssystemer for produksjon av et terapeutisk proteinstoff in vivo19. Tidligere studier har undersøkt optimalisering av CFPS-reaksjonen og cellelysate forberedelsesprosessene4,8,20. Videre har flere teknikker blitt brukt for cellestørrelse liposom forberedelse, for eksempel mikrofluidiske og polymer-baserte dråpestabiliseringsmetoder21,22,23, som også varierer i liposomenes lipidsammensetning24,25,26. I den presenterte protokollen produseres syntetiske celler ved hjelp av en overføringsmetode for vann-i-olje-emulsjon, og innkapslingsprosessen utføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,,10,,24,27,28. Disse milde forholdene har vist seg å være gunstige for å beholde den biofunksjonelle integriteten til molekylærmaskineriet, nemlig ribosomer og proteiner27,,29,30. Lipidsammensetningen av partiklene består av både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). Den første finnes i alle pattedyrcellemembraner og er avgjørende for stabilitet, stivhet og permeabilitetsreduksjon av membranen, og sistnevnte etterligner pattedyrfolipidsammensetning11,13. Den cellulære transkripsjonen og oversettelsesmolekylære maskineriet ekstraheres fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som er forvandlet med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase for å øke CFPS potens og proteinsyntese. Dette systemet har blitt brukt til å produsere diagnostiske og terapeutiske proteiner, med molekylvekter på opptil 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokoll gir en enkel og effektiv metode for produksjon av det syntetiske cellesystemet, som kan løse et bredt spekter av grunnleggende spørsmål knyttet til proteinsyntese i naturen og kan også brukes til narkotikaleveringsapplikasjoner.
Denne protokollen introduserer en enkel og rimelig metode for produksjon av store mengder proteinproduserende syntetiske celler. Avkastningen av aktive celler er avhengig av forsiktig og nøyaktig gjennomføring av protokollen med vekt på flere kritiske trinn. I lysate forberedelsedelen av denne metoden er det viktig å nå riktig bakterietetthet før cellelysis for å oppnå en tilstrekkelig mengde proteiner i bakterielysatet. For det andre bør lysisprosessen utføres ved 4 °C og lysatet frosset raskt med flytende ni…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av ERC-STG-2015-680242.
Forfatterne anerkjenner også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Det tverrfaglige senter for biovitenskap og ingeniørsenter og Israels finansdepartement for et Kamin Grant (52752); Israel Ministry of Science Technology and Space – Office of the Chief Scientist (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske stiftelsen for vitenskapelig forskning og utvikling for en GIF Young stipend (I-2328-1139.10/2012); Den europeiske unions FP-7 IRG-program for en karriereintegrasjonsbevilgning (908049); Fosfolipid Research Center Grant; en Rosenblatt Foundation for kreftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkjenner Alon og Taub Fellowships. O. Adir anerkjenner Sherman og Gutwirth fellesskap. G. Chen anerkjenner Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkjenner Baronesse Ariane de Rothschild Women Doctoral Program fra Rothschild Caesarea Foundation.
A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
1 mM DTT | TCI | D1071 | |
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
Equipment required for step 1 | |||
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
-80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
Equipment required for step 2 | |||
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer |
Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |