Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

Summary

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Abstract

De bottom-up assemblage benadering voor de bouw van synthetische cellen is een effectief instrument voor het isoleren en onderzoeken van cellulaire processen in een cel nabootsen omgeving. Bovendien heeft de ontwikkeling van celvrije expressiesystemen aangetoond dat het vermogen is om de eiwitproductie-, transcriptie- en vertaalprocessen (DNA→RNA→eiwit) op een gecontroleerde manier te reconstrueren, waarbij synthetische biologie wordt gebruikt. Hier beschrijven we een protocol voor de voorbereiding van een cel-vrije expressie systeem, met inbegrip van de productie van een krachtige bacteriële lysaat en inkapselen dit lysaat binnen cholesterol-rijke lipide-gebaseerde gigantische unilamellar vesicles (GUVs) (dat wil zeggen, stabiele liposomen), om synthetische cellen te vormen. Het protocol beschrijft de methoden voor de voorbereiding van de componenten van de synthetische cellen, met inbegrip van de productie van actieve bacteriële lysaten, gevolgd door een gedetailleerde stapsgewijze voorbereiding van de synthetische cellen op basis van een water-in-olie emulsie overdracht methode. Deze vergemakkelijken de productie van miljoenen synthetische cellen op een eenvoudige en betaalbare manier met een hoge veelzijdigheid voor het produceren van verschillende soorten eiwitten. De verkregen synthetische cellen kunnen worden gebruikt om de productie en activiteit van eiwitten/RNA te onderzoeken in een geïsoleerde omgeving, in gerichte evolutie, en ook als een gecontroleerd geneesmiddelenleveringsplatform voor on-demand productie van therapeutische eiwitten in het lichaam.

Introduction

Synthetische cellen zijn kunstmatige celachtige deeltjes, die een of meerdere functies van een levende cel nabootsen, zoals het vermogen om te verdelen, membraaninteracties te vormen en eiwitten te synthetiseren op basis van een genetische code^1,2,3. Synthetische cellen die celvrije eiwitsynthese (CFPS) systemen omsluiten bezitten een hoge modulariteit vanwege hun vermogen om verschillende eiwitten en RNA sequenties te produceren na veranderingen in de DNA-sjabloon. CFPS-systemen zijn gebaseerd op cellysaat, gezuiverde componenten of synthetische componenten en bieden een aantrekkelijk alternatief voor de huidige benaderingen van eiwitproductie en omvatten alle transcriptie- en vertaalmechanismen die nodig zijn voor eiwitsynthese, zoals ribosomen, RNA-polymerase, aminozuren en energiebronnen (bijvoorbeeld 3-fosfhoglyceren en adenine trifosfaat)^4,5,6,7,8,9. De inkapseling van een CFPS-systeem in lipideblaasjes maakt de eenvoudige en efficiënte productie van eiwitten mogelijk zonder afhankelijk te zijn van een levende cel^10. Bovendien, dit platform maakt synthese van peptiden die kunnen degraderen in natuurlijke cellen, de productie van eiwitten die giftig zijn voor levende cellen, en eiwitten te wijzigen met niet-natuurlijke aminozuren^11,12. Synthetische cellen zijn gebruikt als een model voor onderzoeksdoeleinden het onderzoeken van de minimale celcomponenten die nodig zijn om cellulair leven mogelijk te maken vanuit een evolutionair perspectief^1,13. Synthetische cellen zijn ook gebruikt voor het bouwen en implementeren van genetische circuits en als modellen voor gerichte evolutie^14,15,16. Andere studies hebben zich gericht op het vermogen van synthetische cellen om de biologische activiteit van natuurlijke cellen na te bootsen, gericht op het vervangen van beschadigde natuurlijke cellen, zoals bètacellen bij patiënten met diabetes¹⁷. Bovendien illustreert het vermogen van deze CFPS om synthetische cellen in te kapselen om een verscheidenheid aan therapeutische eiwitten te produceren, het potentieel ervan om in klinisch gebruik te worden opgenomen¹⁸.

Hier beschrijven we een bottom-up lab-schaal protocol (Figuur 1) voor de productie van RNA en eiwitproducerende synthetische cellen op basis van een CFPS-systeem ingekapseld in een lipide blaasje. Dit toont het mogelijke gebruik van synthetische celplatforms als nieuwe systemen voor de levering van geneesmiddelen voor de on-site productie van een therapeutisch eiwitmedicijn in vivo^19. Eerdere studies hebben de optimalisatie van de CFPS-reactie en de cellysaatvoorbereidingsprocessen^4,8,20onderzocht. Bovendien zijn verschillende technieken toegepast voor liposoompreparaat ter grootte van celformaat, zoals microfluïdische en polymeergebaseerde druppelstabilisatiemethoden^21,22,23, die ook verschillen in de lipidesamenstelling van liposomen^24,25,26. In het gepresenteerde protocol worden synthetische cellen geproduceerd met behulp van een water-in-olie emulsieoverdrachtsmethode en wordt het inkapselingsproces uitgevoerd bij lage temperaturen (<4 °C)^{5,10,24,27,28}. Deze milde omstandigheden bleken gunstig te zijn voor het behoud van de bio-functionele integriteit van de moleculaire machines, namelijk ribosomen en eiwitten^27,29,30. De lipidesamenstelling van de deeltjes bestaat uit zowel cholesterol als 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC). De eerste is te vinden in alle zoogdiercelmembranen en is essentieel voor de stabiliteit, stijfheid en doorlaatbaarheid vermindering van het membraan, en de laatste bootst zoogdier fosfolipide samenstelling^11,13. De cellulaire transcriptie en vertaling moleculaire machines worden gewonnen uit de BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stam, die wordt getransformeerd met pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase om CFPS potentie en eiwitsynthese te verhogen. Dit systeem is gebruikt voor de productie van diagnostische en therapeutische eiwitten, met moleculaire gewichten tot 66 kDa in vitro en in vivo^19,31. Het volgende protocol biedt een eenvoudige en effectieve methode voor de productie van het synthetische celsysteem, dat een breed scala aan fundamentele vragen in verband met eiwitsynthese in de natuur kan aanpakken en ook kan worden gebruikt voor toepassingen voor de levering van geneesmiddelen.

Protocol

OPMERKING: De afbeelding van het productieprotocol van de volledige synthetische cellen wordt gepresenteerd in figuur 1. Afhankelijk van de behoeften van de gebruiker kunnen de eiwitexpressie (paragraaf 3.2) en de synthetische celvorming (punt 4) delen van het protocol ook onafhankelijk (met enkele aanpassingen) onafhankelijk worden uitgevoerd. 1. Bereiding van S30-T7 lysaat Streepplaat de E. coli BL21(DE3) bacteriën getransformeerd met de T7 R…

Representative Results

We presenteren een protocol voor de bereiding van synthetische cellen door een S30-T7 CFPS-systeem in te kapselen op basis van BL21 E. coli in lipideblaasjes. Een schematische beschrijving van het voorbereidingsproces met een afbeelding van elke fase wordt weergegeven in figuur 2. Het succes van het synthetische celvoorbereidingsproces is afhankelijk van de juiste prestaties van elke fase en wordt uitgevoerd door verschillende parameters. Het protocol moet worden aangepast aan de pr…

Discussion

Dit protocol introduceert een eenvoudige en betaalbare methode voor de productie van grote hoeveelheden eiwitproducerende synthetische cellen. De opbrengst van actieve cellen is afhankelijk van een zorgvuldige en nauwkeurige uitvoering van het protocol met de nadruk op verschillende kritische stappen. In het lysaatpreparaat gedeelte van deze methode, is het essentieel om de juiste bacteriëndichtheid vóór cellyse te bereiken om een voldoende hoeveelheid proteïnen in het bacteriële lysaat te bereiken. Ten tweede moet …

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.