إنتاج ميكرووبوبي من الليسوبيد اتووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو
Summary
يقدم البروتوكول المعلمات المحسنة لإعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة باستخدام جهاز ميكروميكس ميكروميكس الرنجة المتداخل. وهذا يسمح أيضا شارك في تغليف دوكسوروبيسين وindocyanine الخضراء في الليبوزومات والإفراج عن الإفراج عن الدوكسوروبيسين للرقابة / أثار المخدرات.
Abstract
يتيح البروتوكول المقدم إعدادًا مستمرًا عالي الإنتاجية للدهون المنخفضة الحساسية لدرجة الحرارة (LTSLs) ، والقادرة على تحميل أدوية العلاج الكيميائي ، مثل دوكسوروبيسين (DOX). لتحقيق ذلك ، يتم حقن خليط الدهون الايثانولية ومحلول كبريتات الأمونيوم في جهاز ميكرومية عظم الرنجة (SHM) . يتم خلط الحلول بسرعة من قبل SHM ، مما يوفر بيئة مذيبة متجانسة للتجميع الذاتي للدهون. يتم أولاً تسيد الليبوزومات التي تم جمعها، ثم يتم رفعها لإزالة الإيثانول المتبقي. يتم إنشاء تدرج درجة الحموضة كبريتات الأمونيوم من خلال تبادل العازلة من الحل الخارجي باستخدام الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. ثم يتم تحميل DOX عن بعد في الليبوزومات مع كفاءة تغليف عالية (> 80٪). الدهون التي تم الحصول عليها متجانسة في الحجم مع متوسط قطر Z من 100 نانومتر. فهي قادرة على إطلاق انفجار درجة الحرارة الناجمة عن DOX مغلفة في وجود ارتفاع الحرارة المعتدل (42 درجة مئوية). يمكن أيضا ً تحميل الإندوسياين الأخضر (ICG) في الليبوزومات لإطلاق DOX الذي يتم تشغيله بالليزر بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. يضمن نهج microfluidic إعداد LTSLs عالي الإنتاجية والقابل للتكرار وقابلية التوسع.
Introduction
صياغة LTSL هو منتج liposomal ذات الصلة سريريا التي تم تطويرها لتقديم المخدرات العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين (DOX) ويسمح كفاءة انفجار إطلاق المخدرات في ارتفاع الحرارة خفيفة يمكن تحقيقها سريريا (T ☆ 41 درجة مئوية)1. تتكون تركيبة LTSL من 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), الليسوبيد 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidyl (MSPC كولين; M تقف على “أحادية”) وPEGylated الدهون 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين-N-[ميثوكسي (البولي إيثيلين جليكول)-2000] (DSPE-PEG2000). عند الوصول إلى درجة حرارة المرحلة الانتقالية (Tm – 41 درجة مئوية) ، يسهل الليسوبيد وDSPE-PEG2000 معًا تشكيل مسام الأغشية ، مما يؤدي إلى إطلاق انفجار الدواء2. إعداد LTSLs يستخدم في المقام الأول نهج السائبة من أعلى إلى أسفل، وهي ترطيب فيلم الدهون والبثق. يبقى تحديا لإعداد مجموعات كبيرة من الاستنساخ مع خصائص متطابقة وبكميات كافية للتطبيقات السريرية3.
Microfluidics هو تقنية الناشئة لإعداد الليبوزومات، وتقدم حجم الجسيمات النانوية tunable، والاستنساخ، وقابلية التوسع3. بمجرد تحسين معلمات التصنيع ، يمكن توسيع الإنتاجية عن طريق التوازي ، مع خصائص مطابقة لتلك التي أعدت على مقياس مقاعد البدلاء3،4،5. ميزة رئيسية من microfluidics على تقنيات السائبة التقليدية هو القدرة على التعامل مع أحجام السائل الصغيرة مع التحكم عالية في المكان والزمان من خلال تصغير، مما يسمح الأمثل أسرع، في حين تعمل بطريقة مستمرة وآلية6. إنتاج الليبوزومات مع الأجهزة microfluidic يتحقق من خلال نهج nanoprecipitation من أسفل إلى أعلى، وهو أكثر من الوقت وكفاءة الطاقة لأن عمليات التجانس مثل البثق وسونيكيشن غير ضرورية7. وعادة ما يختلط محلول عضوي (مثل الإيثانول) من الدهون (والحمولة الكارهة للماء) بغير مذيب غير قابل للامتزاج (مثل الماء والحمولة المائية). كما يمزج المذيبات العضوية مع غير المذيبات، يتم تقليل الذوبان للدهون. يصل تركيز الدهون في نهاية المطاف إلى تركيز حرج يتم فيه تشغيل عملية هطول الأمطار7. نانوراسب الدهون تنمو في نهاية المطاف في الحجم وقريبة من liposome. والعوامل الرئيسية التي تحكم حجم وتجانس الليبوزومات هي النسبة بين نسبة معدل التدفق غير المذيب ة والمذيبات (أي نسبة معدل التدفق المائية إلى العضوية؛ ونسبة العضوية ونسبة العضوية. FRR) وتجانس البيئة المذيبات خلال التجميع الذاتي للدهون في الليبوزومات8.
وبالتالي فإن خلط السوائل الفعالة في الموائع الدقيقة أمر ضروري لإعداد الليبوزومات المتجانسة ، وقد تم استخدام تصاميم مختلفة من الخلاطات في تطبيقات مختلفة9. يمثل الخلاط المجهري لعظم الرنجة (SHM) أحد الأجيال الجديدة من الخلاطات السلبية ، والتي تمكن من الإنتاجية العالية (في نطاق mL / min) مع عامل تخفيف منخفض. هذا هو متفوقة على أجهزة خلط الهيدروديناميكية microfluidic التقليدية8،10. وقد نقشSHM الأخاج الرنجة، والتي تخلط بسرعة السوائل عن طريق الإزالة الفوضوية9،11. يسمح مقياس الوقت القصير للخلط SHM (< 5 ms، أقل من مقياس وقت التجميع النموذجي من 10-100 مللي ثانية) بحدوث التجميع الذاتي للدهون في بيئة مذيبة متجانسة، مما ينتج جسيمات نانوية ذات توزيع حجم موحد3،12.
إعداد LTSLs مع microfluidics، ومع ذلك، ليست واضحة بالمقارنة مع تركيبات الدهون التقليدية بسبب عدم وجود الكوليسترول8،والتي بدونها ثنائيات الدهون عرضة للinterdigitation الناجم عن الإيثانول13،14،15. حتى الآن ، لم يكن تأثير الايثانول المتبقي يعرض خلال إنتاج microfluidic من الليبوزومات مفهومة جيدا. غالبية التركيبات المبلغ عنها هي بطبيعتها مقاومة للتوسيط (التي تحتوي على الكوليسترول أو الدهون غير المشبعة)16، والتي على عكس LTSLs على حد سواء المشبعة وخالية من الكوليسترول.
البروتوكول المعروض هنا يستخدم SHM لإعداد LTSLs لدرجة الحرارة التي أدت إلى إطلاق المخدرات التسليم. في الطريقة المعروضة ، تأكدنا من أن LTSLs المعدة microfluidic هي نانو الحجم (100 نانومتر) وموحدة (التشتت < 0.2) عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS). وعلاوة على ذلك، قمنا بتغليف DOX باستخدام طريقة تدرج كبريتات الأمونيوم عبر الغشاء (المعروف ة أيضًا باسم التحميل عن بعد)17 كتحقق من سلامة ثنائي الدهون LTSL. التحميل عن بعد من DOX يتطلب liposome للحفاظ على درجة الحموضة التدرج من أجل تحقيق كفاءة عالية التغليف (EE)، وهو ما من غير المرجح أن يحدث دون طبقة الدهون سليمة. في هذه الطريقة المقدمة ، المميزة من بروتوكولات إعداد الدهون المجهرية النموذجية ، يلزم اتخاذ خطوة الصلب قبل إزالة الإيثانول لتمكين القدرة على التحميل عن بعد ؛ أي لاستعادة سلامة طبقة الدهون.
وكما ذُكر سابقاً، يمكن أيضاً إدخال حمولات هيدروفيلية ومسعورة على الحلول الأولية للتغليف المتزامن للحمولات أثناء تشكيل الـ LTSLs. كدليل على مفهوم, indocyanine الأخضر (ICG), ووافقت ادارة الاغذية والعقاقير بالقرب من الأشعة تحت الحمراء صبغة الفلورسنت, الذي هو أيضا عامل الحرارية الضوئية واعدة, يتم إدخال إلى خليط الدهون الأولية وبنجاح شارك في تحميلها في LTSLs. يتم استخدام ليزر 808 نانومتر لتشعيع الـ LTSLs المحملة بـ DOX /ICG ويحفز بنجاح إطلاق الاندفاع الحراري الضوئي الذي تسبب في إطلاق DOX في غضون 5 دقيقة.
جميع الأدوات والمواد متاحة تجاريا، جاهزة للاستخدام، ودون الحاجة إلى التخصيص. وبما أن جميع البارامترات لصياغة الـ LTSLs قد تم تحسينها، بعد هذا البروتوكول، فإن الباحثين الذين ليس لديهم معرفة مسبقة بالميكروسيوليمكن أيضاً أن يعدوا الـ LTSLs، الذي يعمل كأساس لنظام تسليم الأدوية الحساس للحرارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم إعداد الليبوزومات ذات الحساسية المنخفضة لدرجة الحرارة (LTSLs) باستخدام خلاط مجهري عظم الرنجة (SHM). صيغة LTSL10 تمكن من درجة الحرارة التي تسببها إطلاق انفجار من doxorubicin في غضون 5 دقائق في درجة حرارة hyperthermic يمكن تحقيقها سريريا من 42 درجة مئوية. Indocyanine الأخضر (ICG) يمكن أيضا أن تكون ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سرطان البروستاتا في المملكة المتحدة (CDF-12-002 Fellowship) ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية (EP/M008657/1) على التمويل.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA – Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -. H., Kim, J. W., Kim, D. -. H., Han, S. -. H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
