Summary

Produzione microfluidica di liposomi sensibili alla temperatura contengono lysolipid

Published: March 03, 2020
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Summary

Il protocollo presenta i parametri ottimizzati per la preparazione di liposomi termosensibili utilizzando il dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato. Questo permette anche co-incapsulazione di doxorubicina e verde indocianina nei liposomi e il rilascio fototermico innescato di doxorubicina per il rilascio di droga controllato / innescato.

Abstract

Il protocollo presentato consente una preparazione continua ad alto consumo di liposomi sensibili alla bassa temperatura (LTSL), che sono in grado di caricare farmaci chemioterapici, come doxorubicina (DOX). Per raggiungere questo obiettivo, una miscela di lipidi etanolici e una soluzione di solfato di ammonio vengono iniettati in un dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato (SHM). Le soluzioni sono rapidamente mescolate dal SHM, fornendo un ambiente di solvente omogeneo per l’auto-assemblaggio dei liposomi. I liposomi raccolti vengono prima anuniti, quindi dializzati per rimuovere l’etanolo residuo. Un gradiente di pH solfato di ammonio viene stabilito attraverso lo scambio tampone della soluzione esterna utilizzando la cromatografia di esclusione di dimensioni. DOX viene quindi caricato a distanza nei liposomi con elevata efficienza di incapsulamento (> 80%). I liposomi ottenuti hanno dimensioni omogenee con diametro medio di 100 nm. Sono in grado di innescare la temperatura di rilascio a raffica di DOX incapsulato in presenza di ipertermia lieve (42 gradi centigradi). Indocyanine green (ICG) può anche essere co-caricato nei liposomi per il rilascio DOX a infrarossi vicino a infrarossi. L’approccio microfluidico garantisce una preparazione ad alta produttività, riproducibile e scalabile delle LLT.

Introduction

La formulazione LTSL è un prodotto liposomico clinicamente rilevante che è stato sviluppato per fornire il farmaco chemioterapico doxorubicin (DOX)e consente un efficiente rilascio di farmaci a raffica a ipertermia lieve clinicamente raggiungibile (T 41 . La formulazione LTSL è composta da 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), il lysolipido1-stearoyl-2-idrossi-sn -glycero-3-phosphatidylcho (MSPC; M sta per “mono”) e PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Una volta raggiunta la temperatura di transizione di fase (Tm ) , i lincidi e dSPE-PEG2000 insieme facilitano la formazione dei pori della membrana, con conseguente rilascio di scoppio del farmaco2. La preparazione di LTSL utilizza principalmente un approccio bulk dall’alto verso il basso, vale a dire l’idratazione e l’estrusione delle pellicole lipidiche. Resta difficile preparare in modo riproducibile grandi lotti con proprietà identiche e in quantità sufficienti per le applicazioni cliniche3.

La microfluidica è una tecnica emergente per la preparazione dei liposomi, che offre dimensioni delle nanoparticelle regolabili, riproducibilità e scalabilità3. Una volta ottimizzati i parametri di produzione, la velocità effettiva potrebbe essere aumentata mediante parallelizzazione, con proprietà identiche a quelle preparate in scala di panca3,4,5. Uno dei principali vantaggi della microfluidica rispetto alle tecniche di massa convenzionali è la capacità di gestire piccoli volumi di liquidi con elevata controllabilità nello spazio e nel tempo attraverso la miniaturizzazione, consentendo un’ottimizzazione più veloce, operando in modo continuo e automatizzato6. La produzione di liposomi con dispositivi microfluidici è ottenuta da un approccio di nanoprecipitazioni dal basso verso l’alto, che è più efficiente in termini di tempo ed energia perché i processi di omogeneizzazione come l’estrusione e la sonicazione non sono necessari7. Tipicamente, una soluzione organica (ad esempio etanolo) di lipidi (e carico idrofobico) viene mescolata con un non solvente miscibile (ad esempio acqua e carico idrofilo). Come il solvente organico si mescola con il non solvente, la solubilità per i lipidi è ridotta. La concentrazione di lipidi alla fine raggiunge una concentrazione critica in cui viene attivato il processo di precipitazione7. Nanoprecipitati di lipidi alla fine crescono di dimensioni e si chiudono in un liposoma. I principali fattori che regolano le dimensioni e l’omogeneità dei liposomi sono il rapporto tra il non solvente e il solvente (cioè il rapporto di portata acquoso-organico; FRR) e l’omogeneità dell’ambiente solvente durante l’auto-assemblaggio dei lipidi in liposomi8.

La miscelazione efficiente dei fluidi in microfluidica è quindi essenziale per la preparazione di liposomi omogenei, e vari progetti di miscelatori sono stati impiegati in diverse applicazioni9. Il micromixer a spina di pesce sfalsato (SHM) rappresenta una delle nuove generazioni di miscelatori passivi, che consente un’elevata produttività (nella gamma di mL/min) con un fattore di diluizione basso. Questo è superiore ai tradizionali dispositivi di miscelazione idrodinamica microfluidica8,10. Lo SHM ha modellato scanalature a spina di pesce, che mescolano rapidamente fluidi per advezione caotica9,11. La breve scala cronologica di miscelazione di SHM (< 5 ms, inferiore alla tipica scala temporale di aggregazione di 10-100 ms) consente l'autoassemblaggio dei lipidi in un ambiente omogeneo, producendo nanoparticelle con distribuzione uniforme delle dimensioni3,12.

La preparazione di LTSL con microfluidica non è, tuttavia, così semplice rispetto alle formulazioni liposomiche convenzionali a causa della mancanza di colesterolo8, senza il quale i bistrati lipidici sono suscettibili all’interdigitalizzazione indotta dall’etanolo13,14,15. Fino ad ora, l’effetto dell’etanolo residuo si presenta durante la produzione microfluidica di liposomi non è stato ben compreso. La maggior parte delle formulazioni segnalate sono intrinsecamente resistenti all’interdigitazione (contenente colesterolo o lipidi insaturi)16, che a differenza delle LTSL sono sia saturi che privi di colesterolo.

Il protocollo qui presentato utilizza SHM per preparare i LTSL per la somministrazione di farmaci a rilascio di temperatura. Nel metodo presentato, abbiamo assicurato che i LTSL microfluidici-preparati sono nano-dimensioni (100 nm) e uniforme (dispersità < 0.2) da dispersione dinamica della luce (DLS). Inoltre, abbiamo incapsulato DOX usando il metodo del gradiente di solfato di ammonio transmembrana (noto anche come caricamento remoto)17 come convalida dell’integrità del bistrato lipidico LTSL. Il caricamento a distanza del DOX richiede che il liposoma mantenga un gradiente di pH al fine di ottenere un’elevata efficienza di incapsulamento (EE), che è improbabile che si verifichi senza un bistrato lipidico intatto. In questo metodo presentato, distintivo dai tipici protocolli di preparazione del liposoma microfluidico, è necessaria una fase di annealing prima che l’etanolo venga rimosso per abilitare la capacità di caricamento remoto; cioè per ripristinare l’integrità del bistrato lipidico.

Come accennato in precedenza, i carichi idrofili e idrofobici possono anche essere introdotti alle soluzioni iniziali per l’incapsulamento simultaneo dei carichi utili durante la formazione di LTSL. Come proof-of-concept, il verde indocianina (ICG), un coloranti fluorescente a infrarossi vicino alla FDA, che è anche un promettente agente fototermico, viene introdotto nella miscela di lipidi iniziali e co-caricato con successo nelle LSL. Un laser da 808 nm viene utilizzato per irradiare i LTS caricati da DOX/ICG e indurre con successo il rilascio a scoppio di DOX innescato dal riscaldamento fototermico entro 5 min.

Tutti gli strumenti e i materiali sono disponibili in commercio, pronti all’uso e senza bisogno di personalizzazione. Poiché tutti i parametri per la formulazione dei lPSL sono stati ottimizzati, seguendo questo protocollo, i ricercatori senza alcuna conoscenza preliminare della microfluidica potrebbero anche preparare i LTSL, che funge da base per un sistema di somministrazione di farmaci termosensibili.

Protocol

1. Configurazione dell’attrezzatura Assemblare le pompe di siringhe e SHM come segue. Collegare la porta “To Computer” della pompa di siringa secondaria (Pompa 02, per soluzione acquosa) alla porta “To Network” della pompa della siringa master (Pompa 01, per soluzione lipidi etanolo) utilizzando Pump to Pump network cable (Figura 1, giallo). Collegare la porta “Al computer” della pompa master alla porta “RS232 Serial” del computer utilizzando il …

Representative Results

La preparazione di LTSL mediante microfluidica richiede la composizione lipidica di DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, rapporto molare; LTSL10). Figura 7A (sinistra) mostra l’aspetto di LTSL10 preparato dal passaggio 2.9, come un liquido chiaro e non viscoso. La formulazione LTSL10 è sviluppata a partire dalla formulazione convenzionale, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, rapporto molare) poiché LTSL4 forma un camp…

Discussion

Il protocollo presentato descrive la preparazione di liposomi sensibili alla bassa temperatura (LTSL) utilizzando un micromixer a spina di pesce sfalsato (SHM). La formulazione LTSL10 consente il rilascio di scoppio innescato dalla temperatura di doxorubicina entro 5 minuti ad una temperatura ipertermica clinicamente raggiungibile di 42 gradi centigradi. Indocyanina verde (ICG) può anche essere co-caricato per il riscaldamento fototermico innescato il rilascio di DOX. Il metodo si basa su: (i) auto-assemblaggio di fosfo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) e l’Ingegneria e scienze fisiche research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) per il finanziamento.

Materials

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Lipoid PC 16:0/16:0 (DPPC)
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) Lipoid PE 18:0/18:0-PEG 2000
(MPEG 2000-DSPE)
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) Avanti Polar Lipid 855775P-500MG Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC
(Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC)
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375-100G
Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-624 Requires 2 units. For the inlets
Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF IDEX Health & Science P-630 Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules)
Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich 31119-1KG-M
Bijou vial VWR 216-0980 7 mL, clear, polystyrene vial
Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801008 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit
Centrifuge ThermoFisher Scientific Heraeus Megafuge 8R With HIGHConic III Fixed Angle Rotor
Cuvette Fisher Scientific 11602609 Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement
Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi Sigma-Aldrich PURX12015-1KT 12-14 kDa MWCO
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34943-1L-M
DLS Instrument Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS90
Doxorubicin Hydrochloride (DOX) Apollo Scientific BID0120
DSC Instrument TA Instruments TA Q200 DSC
DSC Tzero Hermetic Lids TA Instruments 901684.901 For DSC measurement
DSC Tzero Pans TA Instruments 901683.901 For DSC measurement
DSC Tzero Sample Press Kit TA Instruments 901600.901 For DSC measurement
Ethanol VWR 20821.330 Absolute, ≥99.8%
FC-808 Fibre Coupled Laser System CNI Optoelectronics Tech FC-808-8W-181315 FOC-01-B Fiber Collimator included.
Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-200 For the outlet
Fibre Optic Temperature Probe Osensa PRB-G40
Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) Darwin Microfluidics Herringbone Mixer – Glass Chip
Heating Tape Omega DHT052020LD Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models
Indocyanine Green Adooq A10473-100 Distributed by Bioquote Limited (U.K.)
Luer-lock Syringe, 5 mL VWR 613-2043 Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm
Microplate Reader BMG Labtech FLUOstar Omega Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters
Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom ThermoFisher Scientific 611F96BK For fluorescence measurement in microplate reader
Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom Grenier 655101 For absorbance measurement microplate reader
Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD IDEX Health & Science P-245 For the outlet
PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft World Precision Instruments NE-PC7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 World Precision Instruments SYRINGE-PUMP-PRO-02 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft World Precision Instruments NE-NET7 Optional: Syringe pumps can be operated manually
Size exclusion chromatography (SEC) column GE Life Science 17085101 Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich 31434-1KG-M
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881-500G
Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) World Precision Instruments ALADDIN2-220/AL1000-220
Thermostat Temperature Controller Inkbird ITC-308 Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Tubing, ETFE (1/16" OD) IDEX Health & Science 1516
USB To RS-232 Converter World Precision Instruments CBL-USB-232 Optional: For computer without RS-232 port
Water Bath Grant Instruments Ltd. JB Nova 12

References

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Cheung, C. C. L., Ma, G., Ruiz, A., Al-Jamal, W. T. Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes. J. Vis. Exp. (157), e60907, doi:10.3791/60907 (2020).

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