Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen
Summary
Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.
Abstract
Das vorgestellte Protokoll ermöglicht eine kontinuierliche Hochdurchsatz-Vorbereitung von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen (LTSLs), die in der Lage sind, Chemotherapeutika wie Doxorubicin (DOX) zu laden. Dazu werden ein Ethanol-Lipid-Gemisch und eine Ammoniumsulfatlösung in einen gestaffelten Fischgrät-Mikromixer (SHM) injiziert. Die Lösungen werden schnell vom SHM gemischt und bieten eine homogene Lösungsmittelumgebung für die Liposomen-Selbstmontage. Gesammelte Liposomen werden zuerst geglüht, dann dialysiert, um Restethanol zu entfernen. Durch Pufferaustausch der externen Lösung wird durch Verwendung der Größenausschlusschromatographie ein Ammoniumsulfat-pH-Gradient hergestellt. DOX wird dann mit hoher Verkapselungseffizienz (> 80%) aus der Ferne in die Liposomen geladen. Die erhaltenen Liposomen sind homogen in der Größe mit einem Z-Durchschnittsdurchmesser von 100 nm. Sie sind in der Lage, bei leichter Hyperthermie (42 °C) eine temperaturgesteuerte Burstfreisetzung von gekapseltem DOX zu erreichen. Indocyaningrün (ICG) kann auch in die Liposomen für die nahinfrarote Laser-trigger DOX-Freisetzung mitgeladen werden. Der mikrofluidische Ansatz gewährleistet eine hohe Durchsatz-, reproduzierbare und skalierbare Aufbereitung von LTSLs.
Introduction
Die LTSL-Formulierung ist ein klinisch relevantes liposomales Produkt, das zur Abgabe des Chemotherapeutikums Doxorubicin (DOX) entwickelt wurde und eine effiziente Freisetzung von Burst-Medikamenten bei klinisch erreichbarer leichter Hyperthermie (T bei 41 °C)ermöglicht 1. Die LTSL-Formulierung besteht aus 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC), dem Lysolipid 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (MSPC; M steht für “mono”) und PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Nach Erreichen der Phasenübergangstemperatur (Tm bei 41 °C) erleichtern Lysolipid und DSPE-PEG2000 zusammen die Bildung von Membranporen, was zu einer Burstfreisetzung des Medikaments2führt. Bei der Herstellung von LTSLs wird in erster Linie ein Bulk-Top-Down-Ansatz verwendet, nämlich Lipidfilmhydratation und Extrusion. Es bleibt schwierig, große Chargen mit identischen Eigenschaften und in ausreichenden Mengen für klinische Anwendungen zu reproduzierbar vorzubereiten3.
Mikrofluidik ist eine neue Technik zur Herstellung von Liposomen und bietet abstimmbare Nanopartikelgröße, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit3. Sobald die Fertigungsparameter optimiert sind, kann der Durchsatz durch Parallelisierung skaliert werden, mit Eigenschaften, die mit denen identisch sind, die auf der Tischskala3,4,5vorbereitet werden. Ein großer Vorteil der Mikrofluidik gegenüber herkömmlichen Schüttgütertechniken ist die Fähigkeit, kleine Flüssigkeitsvolumina mit hoher Beherrschung in Raum und Zeit durch Miniaturisierung zu handhaben, was eine schnellere Optimierung ermöglicht, während sie kontinuierlich und automatisiert arbeitet6. Die Herstellung von Liposomen mit mikrofluidischen Geräten wird durch einen Bottom-up-Nanopräzipitierungsansatz erreicht, der zeit- und energieeffizienter ist, da Homogenisierungsprozesse wie Extrusion und Beschallung unnötig sind7. Typischerweise wird eine organische Lösung (z. B. Ethanol) von Lipiden (und hydrophoben Nutzlast) mit einem mischbaren Nichtlösungsmittel (z. B. Wasser und hydrophile Nutzlast) vermischt. Da sich das organische Lösungsmittel mit dem Nichtlösungsmittel vermischt, wird die Löslichkeit für die Lipide reduziert. Die Lipidkonzentration erreicht schließlich eine kritische Konzentration, bei der der Fällungsprozess ausgelöst wird7. Nanopräzipitate von Lipiden wachsen schließlich in der Größe und nähern sich in einem Liposom. Die wichtigsten Faktoren für die Größe und Homogenität der Liposomen sind das Verhältnis zwischen nicht-solvent und lösungsmittel (d. h. wässrig-organisches Durchflussverhältnis; FRR) und die Homogenität der Lösungsmittelumgebung bei der Selbstmontage von Lipiden in Liposomen8.
Effizientes Flüssigkeitsmischen in der Mikrofluidik ist daher für die Herstellung homogener Liposomen unerlässlich, und verschiedene Ausführungen von Mischern wurden in verschiedenen Anwendungen eingesetzt9. Staggered Heringbone Micromixer (SHM) stellt eine der neuen Generationen von passiven Mischern dar, die einen hohen Durchsatz (im Bereich von mL/min) mit einem niedrigen Verdünnungsfaktor ermöglicht. Dies ist den herkömmlichen mikrofluidischen hydrodynamischen Mischvorrichtungen8,10überlegen. Die SHM hat gemusterte Fischgrätrillen, die Flüssigkeiten durch chaotische Advektion schnell mischen9,11. Die kurze Mischzeitskala von SHM (< 5 ms, kleiner als die typische Aggregationszeitskala von 10–100 ms) ermöglicht die Lipidselbstmontage in einer homogenen Lösungsmittelumgebung und erzeugt Nanopartikel mit gleichmäßiger Größenverteilung3,12.
Die Herstellung von LTSLs mit Mikrofluidik ist jedoch nicht so einfach im Vergleich zu herkömmlichen liposomalen Formulierungen aufgrund des Mangels an Cholesterin8, ohne die Lipid-Doppelschichten anfällig für Ethanol-induzierte Interdigitation13,14,15sind. Bisher ist die Wirkung von Restethanol während der mikrofluidischen Produktion von Liposomen nicht gut verstanden worden. Die meisten der gemeldeten Formulierungen sind von Natur aus resistent gegen Interdigitation (mit Cholesterin oder ungesättigten Lipiden)16 ,die im Gegensatz zu LTSLs sowohl gesättigt als auch cholesterinfrei sind.
Das hier vorgestellte Protokoll verwendet SHM, um LTSLs für die Lieferung von Temperatur-Trigger-Freisetzungsmedikamenten vorzubereiten. In der vorgestellten Methode haben wir sichergestellt, dass die mikrofluidisch hergestellten LTSLs nanogroß (100 nm) und gleichmäßig (Dispersity < 0.2) durch dynamische Lichtstreuung (DLS) sind. Darüber hinaus haben wir DOX mit der Transmembran-Ammoniumsulfat-Gradientenmethode (auch als Fernbelastung bezeichnet)17 als Validierung der Integrität der LTSL Lipid-Bilayer gekapselt. Die Fernbelastung von DOX erfordert das Liposom, um einen pH-Gradienten beizubehalten, um eine hohe Verkapselungseffizienz (EE) zu erreichen, was ohne eine intakte Lipid-Bilayer unwahrscheinlich ist. Bei dieser vorgestellten Methode, die sich von typischen mikrofluidischen Liposomenpräparationsprotokollen unterscheidet, ist ein Glühschritt erforderlich, bevor das Ethanol entfernt wird, um die Remote-Ladefähigkeit zu ermöglichen; d.h. die Integrität der Lipid-Bilayer wiederherzustellen.
Wie bereits erwähnt, können hydrophile und hydrophobe Nutzlasten auch in die ersten Lösungen für die gleichzeitige Verkapselung von Nutzlasten während der Bildung von LTSLs eingeführt werden. Als Proof-of-Concept wird Indocyaningrün (ICG), ein von der FDA zugelassener Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, der auch ein vielversprechendes photothermisches Mittel ist, in das ursprüngliche Lipidgemisch eingeführt und erfolgreich in die LTSLs eingeladen. Ein 808 nm Laser wird verwendet, um die DOX/ICG-geladenen LTSLs zu bestrahlen und innerhalb von 5 min erfolgreich photothermische, heizausgelöste Burst-Freisetzung von DOX zu induzieren.
Alle Instrumente und Materialien sind im Handel erhältlich, gebrauchsfertig und ohne Anpassungsbedarf. Da alle Parameter für die Formulierung von LTSLs optimiert wurden, konnten Forscher ohne Vorkenntnisse in der Mikrofluidik auch die LTSLs vorbereiten, die als Grundlage für ein thermosensitives Arzneimittelabgabesystem dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Herstellung von niedrigtemperaturempfindlichen Liposomen (LTSLs) mit einem gestaffelten Fischgrät-Mikromixer (SHM). Die LTSL10-Formulierung ermöglicht eine temperaturgesteuerte Burstfreisetzung von Doxorubicin innerhalb von 5 Minuten bei einer klinisch erreichbaren hyperthermischen Temperatur von 42 °C. Indocyaningrün (ICG) kann auch für photothermische Erwärmung mitgeladen werden, ausgelöst die Freisetzung von DOX. Die Methode beruht auf: (i) Selbstmontage von Phospholipi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship) und dem Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) für die Finanzierung.
Materials
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit – Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer – Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software – SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
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