Summary
这种方法使用质谱成像（MSI）来了解在接触异种生物时 ，S.阿尔巴 叶的代谢过程。该方法允许在特定、完整的组织内对感兴趣的化合物及其预测的代谢物进行空间定位。
Abstract
所介绍的方法使用质谱成像（MSI）来建立 S.阿尔巴 叶在接触异种生物时的代谢轮廓。使用非靶向方法，在植物组织中识别和本地化感兴趣的植物代谢物和异种生物，以发现特定的分布模式。然后，在从已识别的异种生物中预测潜在的代谢物（即代谢物和结合物）。当异生物代谢物位于组织中时，记录植物改变其所涉及的酶类型。这些结果用于描述在 S.alba 叶中发生的不同类型的生物反应，以回应叶子中的异生物积累。代谢物在两代人中预测，允许记录连续的生物反应，以改变叶组织中的异种生物。
Introduction
由于人类活动，异种生物在世界各地广泛分布。其中一些化合物是水溶性，并被土壤1吸收，并进入食物链时，他们积累在植物组织2，3，4。这些植物被昆虫和食草动物吃掉，它们是其他生物的猎物。一些异种生物的摄入及其对植物健康的影响被描述为5，6，7，8，但最近才在组织水平9。因此，目前还不清楚异种生物代谢发生于何处或如何发生，或者特定植物代谢物是否与特定组织中的异生物积累相关。此外，大多数研究忽视了植物中异种生物及其代谢物的新陈代谢，因此对植物组织中的这些反应知之甚少。
这里建议的是一种研究生物样本中的酶反应的方法，该反应可以与基质和反应产品的组织定位相关。该方法可以在一个实验中绘制生物样本的完整代谢剖面，因为分析是无针对性的，并且可以使用感兴趣的定制分析列表进行调查。提供的是在原始数据集中跟踪的候选人列表。如果在样本中注意到一个或几个感兴趣的分析，特定的组织定位可以提供有关相关生物过程的重要信息。然后，利用相关的生物定律在硅中修改感兴趣的分析，以寻找可能的产品/代谢物。然后，通过识别所涉及的酶并本地化组织中的反应来分析原始数据，从而帮助了解发生的代谢过程。没有其他方法提供生物样本中发生的反应类型、感兴趣化合物的本地化及其相关代谢物的信息。一旦有新鲜和完整的组织，并且感兴趣的化合物可以电解，这种方法可用于任何类型的生物材料。拟议的议定书发表在《维莱特》等12 期中，详见此处供科学界使用。
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Protocol
1. 样品准备
- 获取生物样本，要么保持新鲜和完好无损（例如，不要强迫它进入管子），要么将其冻结。拟议的协议适用于任何类型的固体生物样本（即植物、动物或人体组织），以本地化特定组织中的化合物。
- 冷却低温微分到-20°C。 将样品支架和刀片保持在相同的温度下。
- 如有必要，将对象嵌入 M1 嵌入介质中，以便在切割过程中保存它。
- 将一些基质倒入放置在低温微分室的塑料模具中。快速添加样品，并倒入一些更多的嵌入介质，以覆盖它。当基质凝固并冷却时，将样品保持在模具中心。
注：并非所有生物物体都需要嵌入。同质物体，如老鼠的大脑不需要嵌入介质，可以切割冻结。
- 将一些基质倒入放置在低温微分室的塑料模具中。快速添加样品，并倒入一些更多的嵌入介质，以覆盖它。当基质凝固并冷却时，将样品保持在模具中心。
- 将嵌入式或冷冻样品放在低温微分架上，用锋利的刀片切割。5-30 μm 的厚度对植物样本有好处，由于植物样本的异质性，这些样品很难切割。将切割厚度和温度调整到样品中，进行多次切割以找到最佳条件。在提供的示例中，样本被切割为 -20 °C。 考虑将样品保持在 0 °C 以下，以避免样品退化。
注意：使用放置在低温显微镜旁边的双目显微镜可以帮助确定切片的质量。组织必须完好无损。 - 使用钳子或小画笔小心地将切片移到 ITO 涂层的滑梯上，然后将手指放在滑梯下，以加热和干燥样品。将幻灯片保存在冷冻微分室中，直到所有样品都准备好。慢慢将滑梯从房间中滑出，以避免热冲击。
注意：要检查幻灯片的哪一侧涂有 ITO 涂层，请在室温 （RT） 下在幻灯片上放置一滴水。掉落将停留在 ITO 涂层侧或未涂层侧的扁平上。 - 使用薄记号笔或校正液在幻灯片上绘制标记，并在矩阵沉积前使用高分辨率扫描仪扫描。当样品在质谱仪中时，这些标记将用于确定样品在幻灯片上的确切位置。获得精确参照点的最佳方法是绘制十字架。
2. 矩阵沉积
- 准备MALDI矩阵：重70毫克的α-氰诺-4-羟基辛酸（HCCA）基质，并稀释在10mL的水和甲醇溶液（50：50）与0.2%TFA。在RT将矩阵固化10分钟。声波化后可能有额外的固体矩阵。
注：根据感兴趣的分析，可以使用不同类型的 MALDI 矩阵。 - 用100%甲醇清洁基质沉积机器人。
- 使用甲醇和精密擦拭，清洁滑梯，保持样品不接触他们，不删除痕迹。在没有样品的区域中，在幻灯片上添加干净的盖片。然后将幻灯片的这一部分放置在光学探测器上以跟踪矩阵沉积。
注意：要光学跟踪矩阵厚度，滑梯和盖片必须非常干净。 - 使用机器人进行矩阵沉积：在储层中只放置 6 mL 的基质溶液，并添加 2 mL 的 100% 甲醇，总容量为 8 mL。
注：沿沉积的矩阵厚度记录是自动的，可以使用 USB 棒恢复。喷洒方法的开发在这里没有详细说明。
3. 数据获取
- 将矩阵的 1μL 放在 MALDI 板上，以使用矩阵峰值作为参考来校准质谱仪。质谱仪采集方法的开发情况没有详细说明。
- 将 MALDI 板插入源中，单击 ftms 控制软件中的"加载目标"，然后等待板被加载。
- 单击代表 MALDI 板的图像中的点，选择矩阵点的位置。
- 在软件的"示例信息"选项卡中注明示例名称和文件夹。
- 通过单击"收购"开始获取。
- 在收购过程中，使用"MALDI 视频"选项卡上的鼠标指头稍微移动板，使激光点位于不同的点。
- 收购完成后，转到"校准"选项卡，在二次模式下选择HCCA 校准列表，然后单击自动。全球校准结果在"校准图"窗口中表示，对于 SolariX XR 7T，应小于 0.2 ppm。
- 如果校准良好，请单击"接受"并保存方法。
- 样品上的基质沉积完成后，将幻灯片放在幻灯片适配器中，并使用塑料盖检索标记的位置。
- 在灵活的图像软件中，使用打开软件的第一个窗口设置新的成像运行。
- 命名成像运行，选择 结果目录，然后单击 "下一步"。
- 指示鼠标大小（即用户定义的测量区域），选择要使用的方法（在第 3.1 节校准），然后单击 "下一步"。
- 在扫描幻灯片并单击 "下一步"后，加载在第 1.6 步获得的幻灯片的光学图像。
- 图像在更宽的窗口中打开。使用幻灯片上的标记来教导幻灯片的位置：在 ftmsControl中，将 MALDI 视频窗口的目标放在标记的确切位置上，然后返回 felx 图像 并单击光学图像上的完全相同的点。重复三个独立点。带有标记的塑料盖被放置在MALDI板上，以恢复其位置并便于教学。
注意：如果标记是用标记制作的，在幻灯片背面添加白色校正液可以使它们在教学过程中脱颖而出。
- 使用"添加测量区域"工具在柔性图像软件中绘制样品感兴趣的区域。
- 如果要分析几个样本，则保存成像运行和"自动序列"。
- 如果分析多个样本，则使用"自动执行批次流体"启动序列。
注意：定期将数据同步到安全位置。
4. 数据处理
- 将原始数据导入可视化软件 （SCILS 实验室），并创建数据集。此软件中分两个单独的步骤完成此操作。
- 使用"批量导入器"工具并选择原始数据、指示目标目录并单击"导入"。
- 导入后，可以组合多个数据集进行进一步分析。要组合数据集，请使用"文件|新|数据集"工具。
- 选择用于获取的仪器类型，通过单击"+"添加导入数据集，并通过单击和拖动对象来排列图像。
- 检查质量范围设置或在需要时通过指示兴趣范围进行修改。单击 "下一步 "查看导入摘要并启动导入。
- 可视化样品和/或不同样品中不同组织中感兴趣的 m/z。 只需单击 光谱 即可选择感兴趣的 m/z 或在 m/z 框中键入值。
- 如果需要，执行统计测试，以搜索不同组织和/或不同样本之间的共局部或歧视值，以确定感兴趣的 m/z。 这些工具在"工具"菜单中可用，不会在此协议中描述。
- 从对象选项卡中导出感兴趣的m/z（例如，同地化、歧视性化合物）作为.csv文件。如果数据集不是太大（即最多 60，000 行），则也可以导出整个数据集。单击红色箭头指示的兴趣区域右侧的"出口"图标。
- 导入.csv文件，以便在注释软件 （Metaboscape） 中创建新的数据集。点击"项目|导入CSV项目"。请注意，将只考虑确切的 m/z， 并且丢失了同位素配置文件。
注：5.0 软件版本允许从可视化软件直接导入数据，从而能够更准确地注释，因为可以考虑同位素配置文件。 - 附有定制分析列表的注释，这些列表可以从公开的数据库中提取。软件会给出一个模板来创建分析列表。
- 使用预测软件（代谢物预测）对注释化合物的代谢物进行硅基预测。需要开发利益复合物的公式，要么由软件中的用户绘制，要么导入为 .mol 文件。然后，该方法是一个简单的分步协议。
- 恢复代谢物列表，创建分析列表，并在注释软件中使用它用预测代谢物注释原始数据。或者，如果代谢物列表很短，则手动按步骤 4.8 搜索。
- 可视化软件中原始数据中代谢物的组织分布。
- 通过右键单击预测的兴趣代谢物，恢复预测软件中代谢过程中所涉及的酶的名称。
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Representative Results
此协议适用于从暴露于环境中的异种生物的S. alba树中采样的新鲜叶子。这个过程在图1中描述。第一步是准备兴趣样本的薄片。植物样本通常比动物样本更难切割，因为组织是异质的，可以含有水和/或空气。此困难使用嵌入介质处理，在样品周围形成均匀块。矩阵沉积通过使用机器人，避免手部操纵和确保可重复的结果而得到促进。MALDI基质层厚度在整个过程中遵循，并可以记录。数据采集需要学习处理高分辨率质谱仪，并使方法适应正在调查的样品和化合物类型。原始数据导入可视化软件中，以搜索感兴趣的化合物并显示其组织本地化。使用软件中可用的统计工具可以找到歧视性或异地化合物。在此步骤中，仅知道化合物的确切m/z。然后，兴趣化合物导出到注释软件中，该软件可以将确切的m/z与用户定义的感兴趣化合物的自定义列表进行比较。如果确切的m/z与利益复合物的m/z匹配，则会注释它。在代谢剖面调查的背景下，在代谢物的硅酸盐预测中选择了注释化合物。用于生成代谢物的生物反应规则的类型很容易被用户选择，以及预测代谢物的代数。预测代谢物列表可用于注释软件中，以搜索原始数据精确m/z和预测代谢物m/z之间的匹配（图 1）。注释代谢物可以在可视化软件中搜索，以获得其组织本地化 （图 2）。可回收参与原感兴趣化合物代谢的酶，以提取生物样本中发生的代谢反应（图3）。
在这个例子中，在植物叶子中发现了药物特尔米萨坦：它分布在整个组织。在原始数据中预测和搜索了特尔米萨坦的代谢物。注释显示，在叶子的内部组织中发现了一个第一代（I）代谢物，并进一步退化为第二代（II）代谢物，这些代谢物在内部组织中定位，或更普遍地分布在所有叶组织中（图2）。这些结果表明，叶子中具有降解端粒的活性代谢反应。这个过程被应用于叶子中附注的几种感兴趣的化合物，并回收了反应中涉及的酶，以调查它们在植物对异生物积累的反应中的作用。这概述了在 S.阿尔巴 叶（图3）中涉及异种生物代谢的酶。
图1。方法的一般结构。 新的样品被切割并放置在喷洒着适当MALDI基质的ITO涂层滑梯上。MALDI 获取提供原始数据，通过 SCILS 实验室软件可以观察组织内的本地化。代谢景观用于注释，代谢物预测用于代谢物（即催化物和结合）预测。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。在暴露于异种生物的 S. alba 叶上获得的结果示例。 在植物叶子中发现特尔米萨坦，并在所有组织中可视化。在原始数据上预测并注释了 Telmisartan 代谢物，以可视化其组织定位。第一代（I）代谢物C33H32N4O3 主要在内部组织中本地化，而第二代（II）代谢物有时分布更为普遍。这个数字是经维莱特等人12日许可改编的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。全球酶配置文件建议在 S.alba 叶发生的潜在反应，以回应异生物暴露。 对感兴趣对象的代谢物预测和注释表明，潜在的酶反应是导致利益复合物代谢的原因。这个数字是经维莱特等人12日许可改编的。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此协议的关键部分是样品准备：样品必须柔软且完好无损。切割是最困难的部分，因为样品的温度和厚度可能因所研究的样品类型而异。动物组织通常是同质的，更容易切割。植物样本通常包含不同的结构，因此由于刀片遇到软、硬或空血管组织，因此更难保持完好无损。强烈建议在与植物样本一起工作时使用新鲜组织，以避免在亲水组织中形成冰并破坏冰。切片存放在 ITO 涂层滑梯上时，必须轻轻移动。MALDI基质被稍微稀释，以避免用基质晶体堵塞喷雾片，如果在步骤2.4中不添加100%甲醇的2mL，就可能发生这种情况。
这种方法提供了一个简单的一天样品准备协议，提供可重复的结果，由于使用机器人MALDI矩阵沉积。拟议的协议要求在组织切割和质谱成像方面拥有能力，并且只适用于可电离的化合物。然而，它提供分子识别，而无需标签用于免疫化学11。之所以达到高灵敏度，是因为化合物直接电流在组织或细胞中，避免了提取协议12产生的稀释效果。样本以非靶向方式分析，从而可以大规模分析样品中的内源性或异种生物化合物。因此，可以遵循对外源化合物的生物学反应。代谢物的硅基预测与非靶向分析相结合，为经典质谱成像增加了另一个维度，因为代谢反应可以在事先不了解组织中积累的外源化合物的情况下进行监测。迄今为止，只有已知的化合物和一些代谢物被遵循这种方法（例如，给老鼠喂食感兴趣的药物）13。根据拟议的协议，原始化合物及其代谢物可以在组织内本地化，并且可以遵循对外源化合物和/或其代谢物积累的生物反应。
该协议不仅适用于植物对异种生物的反应，还可用于了解动物对药物的反应代谢，遵循植物/真菌相互作用，植物对生物或非生物应力的反应，或了解疾病的演变，揭示感兴趣的组织的代谢过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢查尔斯·皮诺、梅兰妮·拉加里格和雷吉斯·拉维涅在植物样本的MALDI成像样品准备方面的技巧和技巧。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
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