Summary
この方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロセスを理解するために質量分析法イメージング(MSI)を使用しています。この方法により、特定の無傷組織内で、目的の化合物とその予測代謝産物の空間的局在化が可能になります。
Abstract
提示された方法は、異種生物薬にさらされたときに S.アルバ 葉の代謝プロファイルを確立するために質量分析イメージング(MSI)を使用しています。非標的アプローチを使用して、対象となる植物代謝産物および異種生物を特定し、植物組織に局在化して、特定の分布パターンを明らかにする。次いで、同定された異種生物由来の潜在的代謝産物(すなわち、異種物および共役体)のインシリコ予測が行われる。異種代謝産物が組織内に存在する場合、植物による変化に関与する酵素の種類が記録される。これらの結果は、葉の異種蓄積に応答して S.アルバ 葉で起こる生物学的反応の異なるタイプを記述するために使用された。代謝物は2世代で予測され、葉組織の異種生物を変換するための連続した生物学的反応の文書化を可能にした。
Introduction
ゼノビオティックは、人間の活動のために世界中に広く分布しています。これらの化合物のいくつかは、水溶性であり、土壌1によって吸収され、植物組織2、3、4に蓄積すると食物連鎖に入る。植物は、他の生物の餌食である昆虫や草食動物によって食べられます。いくつかの異種生物の摂取と植物の健康への影響は5、6、7、8と記載されていますが、最近では組織レベル9で説明されています。したがって、ゼノビオティックの代謝がどこでどのように起こるのか、または特定の植物代謝産物が特定の組織10における異種生物蓄積に相関しているかどうかはまだ不明である。さらに、ほとんどの研究は、植物の異種生物製剤とその代謝産物の代謝を見落としているので、植物組織におけるこれらの反応についてはほとんど知られていない。
ここで提案されるのが、反応の基質および生成物の組織局在化に関連付けることができる生体試料中の酵素反応を調査する方法である。この方法は、分析が非標的であり、目的の分析対象のカスタムリストを使用して調査することができるので、1つの実験で生物学的サンプルの完全な代謝プロファイルを描くことができます。提供された候補のリストは、元のデータセットで追跡されます。目的の1つまたは複数の検体がサンプルに記載されている場合、特定の組織局在化は、関連する生物学的プロセスに関する重要な情報を提供することができる。その後、対象の検体を関連する生物学的法則を使用して、インシリコで修飾して、可能な製品/代謝産物を検索することができます。得られた代謝産物のリストは、関与する酵素を同定し、組織の反応を局所化することによって元のデータを分析するために使用され、発生する代謝過程を理解するのに役立ちます。他の方法は、生物学的サンプルで発生する反応の種類、目的の化合物の局在化、およびそれらの関連代謝産物に関する情報を提供しません。この方法は、新鮮で無傷の組織が利用可能であり、関心のある化合物をイオン化することができると、任意の種類の生物学的材料に使用することができます。提案された議定書はVilletteら12 で出版され、科学界が使用するためにここに詳述されている。
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Protocol
1. サンプル準備
- 生物学的サンプルを入手し、それを新鮮でそのまま保つ(例えば、チューブに強制しないでください)か、それを凍結してください。提案されたプロトコルは、特定の組織の化合物を局所化するために、あらゆる種類の固体生物学的サンプル(すなわち、植物、動物、またはヒト組織)に適用される。
- クライオミクロトームを-20°Cに冷却します。 サンプルホルダーとブレードを同じ温度に保ちます。
- 必要に応じて、オブジェクトを M1 埋め込みメディアに埋め込み、切断時に保持します。
- クライオミクロトームチャンバーに入れたプラスチック製の金型にマトリックスを注ぎます。迅速にサンプルを追加し、それをカバーするためにいくつかのより多くの埋め込み媒体を注ぎます。冷却中にマトリックスが固化するため、サンプルを金型の中央に維持します。
注:埋め込みは、すべての生物学的オブジェクトに必要ではありません。マウスの脳などの均質な物体は、埋め込み培地を必要とせず、凍結して切断することができます。
- クライオミクロトームチャンバーに入れたプラスチック製の金型にマトリックスを注ぎます。迅速にサンプルを追加し、それをカバーするためにいくつかのより多くの埋め込み媒体を注ぎます。冷却中にマトリックスが固化するため、サンプルを金型の中央に維持します。
- 埋め込みサンプルまたは冷凍サンプルをクライオミクロトームホルダーに置き、鋭利な刃で切ります。5~30μmの厚さは、異質性のために切断が困難な植物サンプルに適しています。切断の厚さと温度をサンプルに合わせ、最良の条件を見つけるためにいくつかのカットを行います。提供した例では、試料を−20°Cで切断した。 サンプルの劣化を避けるために、サンプルを0°C以下に保つことを検討してください。
注:クライオミクロトームの隣に置かれた双眼鏡顕微鏡を使用すると、スライスの品質を決定するのに役立ちます。組織はそのまま残る必要があります。 - 慎重に鉗子または小さい絵筆を使用してITOコーティングされたスライドにスライスを移動し、その後、サンプルをウォームアップし、乾燥するためにスライドの下に指を置きます。すべてのサンプルが準備ができるまで、スライドをクライオミクロトームチャンバーに保管してください。熱ショックを避けるためにゆっくりとチャンバーからスライドを取り出します。
メモ:スライドのどちら側がITOコーティングされているかを確認するには、室温(RT)でスライドに水滴を置きます。ドロップは、ITOコーティングされた側に丸いままになるか、コーティングされていない側に平らになります。 - 薄いマーカーペンまたは補正液を使用してスライド上にマークを描画し、マトリックスの堆積前に高解像度スキャナでスキャンします。このマークは、質量分析計内にあるサンプルのスライド上の正確な位置を決定するために使用されます。正確な基準点を得る最善の方法は、十字を描く方法です。
2. マトリックス蒸着
- MALDIマトリックスを準備する:70mgのαシアノ-4-ヒドロキシシンミン酸(HCCA)マトリックスを秤量し、0.2%TFAで水とメタノール溶液(50:50)の10 mLで希釈します。RTで10分間マトリックスを超音波処理します。超音波処理後に余分な固体マトリックスがあるかもしれません。
注: MALDI 行列の種類は、対象の検数に応じて使用できます。 - マトリックス蒸着ロボットを100%メタノールで洗浄します。
- メタノールと精密ワイプを使用して、スライドを清掃し、サンプルに触れることなく、マークを取り外すことなく、スライドを清掃します。サンプルのない領域のスライドの上にきれいなカバースリップを追加します。スライドのその部分は、マトリックスの堆積を追跡するために光学検出器の上に配置されます。
メモ:マトリックスの厚さを光学的に追跡するには、スライドとカバースリップが非常にきれいでなければなりません。 - マトリクス堆積のためにロボットを使用する:6 mLのマトリックス溶液を貯蔵所に入れ、2mLを100%メタノールを加えて、合計体積8mLを加える。
注:堆積に沿ったマトリックスの厚さの記録は自動で、USBスティックを使用して回復することができます。噴霧法の開発についてはここでは詳しく説明していません。
3. データ取得
- MALDIプレート上にマトリックスの1μLを置き、マトリックスピークを基準として質量分析計を較正します。質量分析計の取得方法の開発については、ここでは詳しく説明していません。
- ソースに MALDI プレートを挿入し、ftmsControl ソフトウェアの [ターゲットのロード] をクリックし、プレートがロードされるのを待ちます。
- MALDIプレートを表す画像内のスポットをクリックして、マトリクススポットの位置を選択します。
- ソフトウェアの [サンプル情報] タブで、サンプル名とフォルダを指定します。
- 「取得」をクリックして取得を開始します。
- 取り込み中に、レーザーが異なるスポットをポイントするように、マウス ポインタを[MALDI ビデオ] タブで少し動かします。
- 取得が完了したら、[校正] タブに移動し、 2 次モードでHCCA キャリブレーションリストを選択し、 [自動] をクリックします。グローバルキャリブレーション結果は「キャリブレーションプロット」ウィンドウに表示され、SolariX XR 7Tの場合は0.2ppm未満である必要があります。
- キャリブレーションが正常に行われれば、[承諾] をクリックして、メソッドを保存します。
- サンプルのマトリックスの堆積が完了したら、スライドをスライド アダプターに配置し、プラスチック カバーを使用してマークの位置を取得します。
- flexImagingソフトウェアでは、ソフトウェアで開く最初のウィンドウを使用して新しいイメージング実行を設定します。
- イメージング実行に名前を付け、 結果ディレクトリを選択して、[ 次へ] をクリックします。
- ラスター サイズ (つまり、ユーザー定義の測定領域) を指定し、使用する方法 (セクション 3.1 で調整) を選択し、[ 次へ] をクリックします。
- スライドをスキャンした後、ステップ 1.6 で取得したスライドの光学画像をロードし、[ 次へ] をクリックします。
- 画像が広いウィンドウで開きます。スライドの位置を教えるためにスライド上のマークを使用してください: ftmsControlで、マークの正確な位置に MALDI ビデオ ウィンドウのターゲットを配置し 、felxImaging に戻って、光学画像上のまったく同じ点をクリックします。3 つの独立したポイントに対してこの操作を繰り返します。マークを付けたプラスチックカバーは、MALDIプレート上に置かれ、その位置を回復し、教えることを容易にします。
注:マークがマーカーで作られた場合、スライドの後ろに白い補正液を追加すると、教えの間に目立つ可能性があります。
- 「計測領域の追加」ツールを使用して、flexImaging ソフトウェアのサンプルに対象領域を描画します。
- 複数のサンプルを解析する場合は、イメージングの実行と"AutoXecute シーケンス" を保存します。
- 複数のサンプルを分析する場合は、"AutoXecute バッチ ランナー" を使用してシーケンスを起動します。
注: データを定期的に安全な場所に同期してください。
4. データ処理
- 生データをビジュアライゼーション ソフトウェア (SCiLS Lab) にインポートし、データセットを作成します。これは、このソフトウェアの2つの別々のステップで行われます。
- [バッチインポータ] ツールを使用して、生データを選択し、ターゲット ディレクトリを指定して、[インポート] をクリックします。
- インポート後、複数のデータセットを組み合わせて、さらに分析することができます。データセットを結合するには、"ファイル|新しい|データセット" ツール。
- 取得に使用する計測器のタイプを選択し、インポートしたデータセットを追加するには「+"」をクリックし、オブジェクトをクリックしてドラッグして画像を配置します。
- マス範囲の設定を確認するか、必要に応じて、対象範囲を指定して変更します。[ 次へ ] をクリックしてインポートの概要を表示し、インポートを開始します。
- サンプルの異なる組織や異なるサンプルで、関心のある m/z を視覚化します。 スペクトル をクリックして対象の m/z を選択するか、または m/z ボックスに値を入力します。
- 異なる組織や異なるサンプル間で共局化または判別型の値を検索する必要がある場合は、統計的検定を実行して、関心のある m/z を決定します。ツールは [ツール] メニューで使用でき、このプロトコルでは説明しません。
- 対象の m/z (たとえば、共局化された、判別型化合物) を、[ オブジェクト ] タブから.csv ファイルとしてエクスポートします。データセット全体が大きすぎない場合 (つまり、最大 60,000 行) エクスポートすることもできます。赤い矢印で示された対象地域の右側にある [エクスポート] アイコンをクリックします。
- .csv ファイルをインポートして、アノテーション ソフトウェア (Metaboscape) に新しいデータセットを作成します。「プロジェクト」をクリック|CSV プロジェクトのインポート".正確な m/z のみが考慮され、同位体プロファイルが失われることに注意してください。
注: 5.0 ソフトウェア バージョンでは、同位体プロファイルを考慮できるため、より正確なアノテーションを実現する視覚化ソフトウェアからデータを直接インポートできます。 - 一般に公開されているデータベースから派生できるカスタム作成のアナライト リストで、アナタイズします。テンプレートは、ソフトウェアによって提供され、アナライトリストを作成します。
- 予測ソフトウェア(代謝産物予測)を使用して、アノセトされた化合物の代謝産物のインシリコ予測を行う。対象化合物の開発された式は、ソフトウェアでユーザーによって描画されるか、または.molファイルとしてインポートされるのいずれかが必要です。その後、この方法は単純なステップバイステップのプロトコルです。
- 代謝産物のリストを回復し、分析対象リストを作成し、アノテーション ソフトウェアで使用して、予測された代謝物で生データに注釈を付けます。または、代謝物のリストが短い場合は、ステップ 4.8 で手動で検索します。
- 可視化ソフトウェアの生データにおける代謝産物の組織分布を可視化する。
- 予測ソフトウェアの代謝プロセスに関与する酵素の名前を右クリックして、目的の予測代謝産物を右クリックして回復します。
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Representative Results
このプロトコルは、環境中の異種生物剤にさらされたS.アルバの木から採取された新鮮な葉に適用された。このプロセスを図1に示します。最初のステップは、目的のサンプルの薄いスライスを準備することです。植物サンプルは、組織が不均一であり、水や空気を含むことができるため、動物のサンプルよりも切断が困難であることが多いです。この難易度は、サンプルの周りに均質なブロックを形成する埋め込み媒体を使用して処理されます。マトリクスの堆積は、ロボットの使用によって容易に行われ、手操作を回避し、再現性のある結果を保証します。MALDIマトリックス層の厚さは、プロセス全体の間に続き、記録することができます。データ取得では、高解像度の質量分析計を処理し、その方法を調査中のサンプルや化合物の種類に合わせる方法を学習する必要があります。生データは可視化ソフトウェアにインポートされ、目的の化合物を検索し、それらの組織の局在を表示します。差別的または共局的な化合物は、ソフトウェアで利用可能な統計ツールを使用して見つけることができます。このステップでは、化合物の正確なm/zのみが知られている。その後、対象となる化合物がアノテーション ソフトウェアにエクスポートされ、正確なm/zと、ユーザーが定義した対象化合物のカスタム リストを比較できます。正確なm/zが対象のコンパウンドのm/zと一致する場合は、その値にアポイントニングされます。代謝プロファイル調査のコンテキストでは、アポイント化された化合物は、代謝産物のインシリコ予測で選択される。代謝産物を生成するために使用される生物学的反応規則の種類は、ユーザーによって簡単に選択され、代謝産物が予測される世代数も容易に選択されます。予測された代謝物のリストは、アノテーションソフトウェアで使用して、生データの正確なm/zと予測された代謝物m/zとの一致を検索できます (図 1)。アソシエートされた代謝産物を可視化ソフトウェアで検索して組織局在化を得ることができる(図2)。目的の元の化合物の代謝に関与する酵素を回収して、生体試料に生じる代謝反応を引き出すことができる(図3)。
この例では、テルミサルタンの薬物が植物の葉で同定されました。それは組織全体に分布していた。テルミサルタンの代謝産物は、生データで予測され、検索されました。注釈は、1つの第一世代(I)代謝産物が葉の内部組織で検出され、さらに第二世代(II)代謝産物に分解され、内部組織に局在していたか、またはより一般的にすべての葉組織に分布していたことを示した(図2)。これらの結果は、テルミサルタンを分解する葉の活性代謝反応を示唆する。このプロセスは、葉に注目されているいくつかの目的の化合物に適用され、反応に関与する酵素を回収して、異種生物学的蓄積に対する植物の反応におけるその役割を調査した。これは、S.アルバ葉における異種生物系代謝に関与する酵素の概要を示す(図3)。
図 1.メソッドの一般的な構造。 新鮮なサンプルをカットし、適切なMALDIマトリックスをスプレーしたITOコーティングスライドに置かれます。MALDIの獲得はSCiLSの実験室のソフトウェアのティッシュ内の局在を観察することができる生データを提供する。メタボスケープはアノテーションに使用され、代謝産物予測は代謝産物(すなわち、カボライトおよび共役)予測に使用される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ゼノビオティックスにさらされたS.アルバ葉に対して得られた結果の例。テルミサルタンは植物の葉で同定され、すべての組織で視覚化された。テルミサルタン代謝産物は、その組織の局在を視覚化するために生データに対して予測され、コメント化された。第1世代(I)代謝産物C33H32N4O3は主に内部組織に局在し、第二世代(II)代謝産物はより一般的に分布していた。この図は、ヴィレットら12.の許可を得て適応された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.異種生物暴露に応答して S.アルバ 葉で起こる潜在的な反応について提案された世界的な酵素プロファイル。 対象物に対する代謝産物の予測および注釈は、目的の化合物の代謝を担う潜在的な酵素反応を示唆した。この図は、ヴィレットら12.の許可を得て適応された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの重要な部分はサンプルの準備です: サンプルはソフトで、そのままでなければなりません。サンプルの温度と厚さは、試験したサンプルの種類によって異なる場合がありますので、切断は最も困難な部分です。動物組織は通常均質で、切りやすくなる。植物サンプルは、多くの場合、異なる構造を組み込むため、ブレードが柔らかい、硬い、または空の血管組織に遭遇するので、そのまま維持することがより困難です。植物サンプルを使用して作業する際には、親水性組織の氷の形成とその破壊を避けるために、新鮮な組織を使用することを強くお勧めします。スライスは、ITOコーティングされたスライドに堆積する際に、穏やかに移動する必要があります。MALDIマトリックスは、マトリックス結晶でのスプレーシートの詰まりを避けるためにわずかに希釈し、ステップ2.4で100%メタノールの2mLが添加されない場合に起こり得る。
この方法はMALDIマトリックスの堆積のためのロボットの使用による再生可能な結果を提供する容易な1日のサンプルの準備の議定書を提供する。提案されたプロトコルは、組織切断および質量分析イメージングにおける能力を必要とし、イオン化できる化合物にのみ適用される。しかし、免疫体化学11で用いられるラベリングを必要とせずに分子同定を提供する。高感度は、化合物が組織または細胞内で直接イオン化されるために達成され、抽出プロトコル12によって生成される希釈効果を回避する。サンプルは非標的の方法で分析され、サンプル中の内因性または異種化合物の大規模なプロファイリングが可能になる。したがって、外因性化合物に対する生物学的応答が続く。非標的分析に結合された代謝産物のインシリコ予測は、組織に蓄積する外因性化合物の予備知識なしに代謝反応を監視することができるため、古典的な質量分析画像に別の次元を追加します。現在までに、既知の化合物といくつかの代謝物だけがこの方法(例えば、対象の薬物をラットに供給する)13に従っている。提案されたプロトコルを使用すると、元の化合物とその代謝産物を組織内に局在化することができ、外因性化合物および/またはその代謝産物の蓄積に対する生物学的応答を追跡することができる。
このプロトコルは、異種生物剤に対する植物の反応に適用されるだけでなく、薬物に反応して動物代謝を理解したり、植物/真菌相互作用に従ったり、生物的または非生物的ストレスに対する植物反応を理解したり、疾患の進化を理解したり、目的の組織の代謝過程を明らかにするためにも使用できます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
チャールズ・ピノー、メラニー・ラガリグ、レジス・ラヴィーンの皆様に、植物サンプルのMALDIイメージングのサンプル調製に関するヒントやコツをお願いします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
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