قياس التقاء iPSCs باستخدام نظام التصوير الآلي.
Summary
الهدف من البروتوكول هو مقارنة ظروف طلاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) المختلفة لتقييم كيفية تأثير الطلاء التفاضلي على معدل نمو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). على وجه الخصوص ، نهدف إلى تهيئة الظروف للحصول على النمو الأمثل لثقافات iPSC.
Abstract
تركز هذه الدراسة على فهم كيف يمكن أن تؤثر زراعة iPSCs على ركائز طلاء ECM المختلفة على التقاء الخلايا. تم إنشاء بروتوكول لتقييم التقاء iPSC في الوقت الفعلي دون الحاجة إلى عد الخلايا في تعليق خلية واحدة لتجنب أي اضطراب في النمو. تم استخدام نظام تحليل الصور عالي المحتوى لتقييم التقاء iPCS على 4 ECMs مختلفة بمرور الوقت بطريقة آلية. تم استخدام إعدادات تحليل مختلفة لتقييم التقاء الخلايا من iPSCs الملتصقة ولم يلاحظ سوى اختلاف طفيف (في 24 و 48 ساعة مع laminin) سواء تم تطبيق قناع 60 أو 80 أو 100٪. نظهر أيضا أن laminin يؤدي إلى أفضل التقاء مقارنة ب Matrigel و vitronectin و fibronectin.
Introduction
يتم الحصول على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من الخلايا الجسدية ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا. غالبا ما يتم استخدامها كنظام لنمذجة التسبب في المرض أو إجراء فحص المخدرات ، كما أنها توفر إمكانية استخدامها في سياق الطب الشخصي. نظرا لأن iPSCs لديها إمكانات كبيرة ، فمن المهم توصيفها بالكامل لاستخدامها كنظام نموذجي موثوق. لقد أظهرنا سابقا أهمية زراعة iPSCs في بيئة نقص الأكسجين حيث تعتمد هذه الخلايا على تحلل السكر ويمكن أن تتسبب البيئة الهوائية في اختلال الأكسدةوالاختزال 1. كما أن iPSCs معرضة أيضا لظروف الاستزراع الأخرى ، لا سيما البيئة خارج الخلية. يعد تحسين ظروف الاستزراع قضية رئيسية للحفاظ على صحتهم وتكاثرهم. ستؤدي ثقافة iPSC الصحية إلى خلايا متمايزة صحية تكون عموما نقطة النهاية للنموذج المستخدم لفهم السمات الجزيئية والخلوية والوظيفية لاضطرابات بشرية أو عمليات خلوية محددة.
في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتوكول بسيط لاختبار التقاء iPSCs باستخدام ظروف طلاء مختلفة في آبار منفصلة. تتطلب iPSCs طبقة مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEF) من أجل الالتصاق بشكل صحيح ، لكن التعايش بين iPSCs و MEF يجعل من الصعب إجراء تحليل مثل الحمض النووي الريبي أو استخراج البروتين نظرا لوجود مجموعتين من الخلايا. من أجل تجنب طبقة التغذية ، تم استخدام بروتينات مختلفة تنتمي إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) لإعادة إنشاء مكانة الخلية الطبيعية والحصول على ثقافة iPSC خالية من التغذية. على وجه الخصوص ، Matrigel عبارة عن مستحضر غشاء قاعدي قابل للذوبان مستخرج من ساركوما الماوس Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، والتي يتم تخصيبها في بروتينات مصفوفة خارج الخلية (أي laminin ، الكولاجين IV ، بروتيوغليكان كبريتات الهيباران ، entactin / nidogen ، وعوامل النمو)2,3. شروط الطلاء الأخرى المستخدمة هي بدلا من ذلك البروتينات المنقاة ذات الصلة المعروفة في بناء ECMs: من المعروف أن laminin-521 تفرزه الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في كتلة الخلايا الداخلية للجنين وهي واحدة من أكثر اللامينين شيوعا في الجسم بعد الولادة4،5،6،7،8،9 ، 10,11; vitronectin عبارة عن مصفوفة زراعة خلايا خالية من xeno معروفة بدعم نمو وتمايز hPSC12،13،14،15،16 ؛ الفبرونيكتين هو بروتين ECM مهم لتطور الفقاريات وربط وصيانة الخلايا الجذعية الجنينية في حالة متعددة القدرات17،18،19،20،21،22،23،24،25. نظرا لتوفر ظروف طلاء مختلفة ، فإننا نقارنها من حيث تأثيرها على التقاء iPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن استخدام iPSCs لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية في المستقبل جنبا إلى جنب مع تطبيقها المحتمل في الطب الدقيق يجعلها تقنية ذات أهمية كبيرة ولهذا السبب نعتقد أنه من الضروري أن نفهم بوضوح حالة الزراعة في المختبر التي تشبه بشكل أفضل الحالة الفسيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية. في هذا السياق ، اختبر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الدراسة بمنح من مؤسسة بامبينو جيسو و Ricerca Corrente (وزارة الصحة الإيطالية) إلى C.C. نود أن نشكر الدكتور إنريكو بيرتيني (قسم علم الأعصاب ، وحدة الأمراض العصبية العضلية والتنكسية العصبية ، مختبر الطب الجزيئي ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، الدكتورة ستيفانيا بيتريني (المرفق الأساسي للفحص المجهري البؤري ، مختبرات الأبحاث ، مستشفى بامبينو جيسو لأبحاث الأطفال) ، جوليا بيريكولي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) وروبرتا فيريتي (قسم أمراض الدم والأورام والعلاج الجيني والخلوي ، مستشفى أبحاث الأطفال بامبينو جيسو) للمناقشات العلمية والمساعدة الفنية. حصلت ماريا فينشي على “زمالة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. 생화학. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. 생화학. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
