Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.
Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, verschiedene extrazelluläre Matrix-Beschichtungsbedingungen (ECM) zu vergleichen, um zu beurteilen, wie sich eine differentielle Beschichtung auf die Wachstumsrate von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auswirkt. Insbesondere wollen wir Bedingungen schaffen, um ein optimales Wachstum von iPSC-Kulturen zu erreichen.
Abstract
Diese Studie konzentriert sich auf das Verständnis, wie wachsende iPS-Zellen auf verschiedenen ECM-Beschichtungssubstraten die Zellkonfluenz beeinflussen können. Es wurde ein Protokoll zur Bewertung der iPSC-Konfluenz in Echtzeit erstellt, ohne dass Zellen in Einzelzellsuspension gezählt werden müssen, um Wachstumsstörungen zu vermeiden. Ein High-Content-Bildanalysesystem wurde verwendet, um die iPCS-Konfluenz auf 4 verschiedenen ECMs im Laufe der Zeit automatisiert zu bewerten. Verschiedene Analyseeinstellungen wurden verwendet, um die Zellkonfluenz von adhärenten iPS-Zellen zu beurteilen, und es wurde nur ein geringer Unterschied (nach 24 und 48 Stunden mit Laminin) beobachtet, ob eine 60-, 80- oder 100%-Maske angewendet wurde. Wir zeigen auch, dass Laminin im Vergleich zu Matrigel, Vitronektin und Fibronektin zum besten Zusammenfluss führt.
Introduction
Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) werden aus somatischen Zellen gewonnen und können in verschiedene Zelltypen differenziert werden. Sie werden oft als System zur Modellierung der Krankheitspathogenese oder zur Durchführung von Medikamentenscreenings eingesetzt und bieten auch das Potenzial, im Kontext der personalisierten Medizin eingesetzt zu werden. Da iPSCs ein großes Potenzial haben, ist es wichtig, sie für den Einsatz als zuverlässiges Modellsystem vollständig zu charakterisieren. Wir haben bereits gezeigt, wie wichtig es ist, iPS-Zellen in einer hypoxischen Umgebung zu züchten, da diese Zellen auf Glykolyse angewiesen sind und eine aerobe Umgebung ein Redoxungleichgewicht verursachen kann1. iPSCs sind auch anfällig für andere Kulturbedingungen, insbesondere die extrazelluläre Umgebung. Die Optimierung der Kulturbedingungen ist ein Schlüsselthema, um sie gesund zu halten und zu vermehren. Eine gesunde iPSC-Kultur führt zu gesunden, differenzierten Zellen, die im Allgemeinen der Endpunkt des Modells sind, das zum Verständnis molekularer, zellulärer und funktioneller Merkmale spezifischer menschlicher Störungen oder zellulärer Prozesse verwendet wird.
In dieser Studie wurde ein einfaches Protokoll verwendet, um den Zusammenfluss von iPSCs unter Verwendung verschiedener Beschichtungsbedingungen in separaten Vertiefungen zu testen. iPSCs benötigen eine Feederschicht von murinen embryonalen Fibroblasten (MEF), um richtig zu binden, aber die Koexistenz von iPSCs und MEF macht es schwierig, Analysen wie RNA- oder Proteinextraktion durchzuführen, da zwei Zellpopulationen vorhanden sind. Um die Feederschicht zu vermeiden, wurden verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) verwendet, um die natürliche Zellnische nachzubilden und eine feederfreie iPSC-Kultur zu haben. Insbesondere ist Matrigel ein lösliches Basalmembranpräparat, das aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maussarkom extrahiert wird und mit extrazellulären Matrixproteinen (d. h. Laminin, Kollagen IV, Heparansulfat-Proteoglykanen, Entactin/Nidogen und Wachstumsfaktoren) angereichert ist2,3. Die anderen verwendeten Beschichtungsbedingungen sind stattdessen gereinigte Proteine mit bekannter Relevanz für den Aufbau der ECMs: Laminin-521 ist dafür bekannt, von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in der inneren Zellmasse des Embryos sezerniert zu werden, und es ist eines der häufigsten Lamininine im Körper nach der Geburt 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronectin ist eine xenofreie Zellkulturmatrix, von der bekannt ist, dass sie das Wachstum und die Differenzierung von hPSC 12,13,14,15,16 unterstützt; Fibronektin ist ein ECM-Protein, das für die Entwicklung von Wirbeltieren und die Anheftung und Erhaltung embryonaler Stammzellen in einem pluripotenten Zustand wichtig ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Da unterschiedliche Beschichtungsbedingungen zur Verfügung stehen, vergleichen wir sie hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Zusammenfluss von iPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von iPS-Zellen für die Krankheitsmodellierung und das zukünftige Arzneimittelscreening zusammen mit ihrer möglichen Anwendung in der Präzisionsmedizin macht sie zu einer Technologie von großer Relevanz, und aus diesem Grund glauben wir, dass es notwendig ist, die In-vitro-Kultivierungsbedingungen klar zu verstehen, die der physiologischen Situation embryonaler Stammzellen besser ähneln. In diesem Zusammenhang haben wir verschiedene ECM-Beschichtungen mit Wildtyp-iPSCs getestet, um die Bedingungen zu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde durch Zuschüsse der Fondazione Bambino Gesù und Ricerca Corrente (italienisches Gesundheitsministerium) an C.C. Wir danken Dr. Enrico Bertini (Abteilung für Neurowissenschaften, Abteilung für neuromuskuläre und neurodegenerative Erkrankungen, Labor für Molekulare Medizin, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Kerneinrichtung für Konfokale Mikroskopie, Forschungslabors, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Abteilung für Onkohämatologie, Gen- und Zelltherapie, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù) und Roberta Ferretti (Abteilung für Onkohämatologie, Gen- und Zelltherapie, Kinderforschungsklinik Bambino Gesù) für wissenschaftliche Diskussionen und technische Hilfe. Maria Vinci ist Empfängerin eines “Children with Cancer UK Fellowship”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
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