Medición de la confluencia de iPSCs utilizando un sistema automatizado de imágenes.
Summary
El objetivo del protocolo es comparar diferentes condiciones de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) para evaluar cómo el recubrimiento diferencial afecta la tasa de crecimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En particular, nuestro objetivo es establecer las condiciones para obtener un crecimiento óptimo de los cultivos iPSC.
Abstract
Este estudio se centra en comprender cómo el cultivo de iPSC en diferentes sustratos de recubrimiento ECM puede afectar la confluencia celular. Se ha establecido un protocolo para evaluar la confluencia de iPSC en tiempo real sin necesidad de contar células en suspensión unicelular para evitar cualquier perturbación del crecimiento. Se utilizó un sistema de análisis de imágenes de alto contenido para evaluar la confluencia de iPCS en 4 ECM diferentes a lo largo del tiempo de manera automatizada. Se utilizaron diferentes entornos de análisis para evaluar la confluencia celular de las iPSCs adherentes y solo se observó una ligera diferencia (a las 24 y 48 horas con laminina) si se aplicó una máscara al 60, 80 o 100%. También mostramos que la laminina conduce a la mejor confluencia en comparación con Matrigel, vitronectina y fibronectina.
Introduction
Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se obtienen de células somáticas y se pueden diferenciar en diferentes tipos de células. A menudo se utilizan como un sistema para modelar la patogénesis de la enfermedad o realizar la detección de drogas, y también ofrecen el potencial de ser utilizados en el contexto de la medicina personalizada. Dado que las iPSC tienen un gran potencial, es importante caracterizarlas completamente para su uso como un sistema modelo confiable. Anteriormente mostramos la importancia de cultivar iPSCs en un ambiente hipóxico, ya que estas células dependen de la glucólisis y un ambiente aeróbico puede causar desequilibrio redox1. Las iPSC también son vulnerables a otras condiciones de cultivo, particularmente al entorno extracelular. La optimización de las condiciones de cultivo es un tema clave para mantenerlas sanas y proliferantes. Un cultivo saludable de iPSC conducirá a células sanas diferenciadas que generalmente son el punto final del modelo utilizado para comprender las características moleculares, celulares y funcionales de trastornos humanos específicos o procesos celulares.
En este estudio, se ha utilizado un protocolo simple para probar la confluencia de iPSCs utilizando diferentes condiciones de recubrimiento en pozos separados. Las iPSC requieren una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios murinos (MEF) para adherirse correctamente, pero la coexistencia de iPSCs y MEF dificulta la realización de análisis como ARN o extracción de proteínas, ya que hay dos poblaciones de células. Para evitar la capa de alimentación, se han utilizado diferentes proteínas pertenecientes a la matriz extracelular (ECM) para recrear el nicho celular natural y tener un cultivo de iPSC libre de alimentador. En particular, Matrigel es una preparación solubilizada de membrana basal extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que está enriquecida en proteínas de la matriz extracelular (es decir, laminina, colágeno IV, proteoglicanos de heparán sulfato, entactina/nidógeno y factores de crecimiento)2,3. Las otras condiciones de recubrimiento utilizadas son, en cambio, proteínas purificadas con relevancia conocida en la construcción de las ECM: se sabe que la laminina-521 es secretada por células madre pluripotentes humanas (hPSC) en la masa celular interna del embrión y es una de las lamininas más comunes en el cuerpo después del nacimiento 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina es una matriz de cultivo celular libre de xeno-conocida por apoyar el crecimiento y la diferenciación de hPSC 12,13,14,15,16; La fibronectina es una proteína ECM importante para el desarrollo de vertebrados y la unión y mantenimiento de células madre embrionarias en estado pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Dado que existen diferentes condiciones de recubrimiento, las comparamos en términos de su efecto sobre la confluencia de las iPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de iPSCs para el modelado de enfermedades y el futuro cribado de fármacos junto con su posible aplicación en medicina de precisión lo convierte en una tecnología de gran relevancia y por esta razón creemos que es necesario entender claramente la condición de cultivo in vitro que mejor se asemeja a la situación fisiológica de las células madre embrionarias. En este contexto, probamos diferentes recubrimientos ECM utilizando iPSC de tipo salvaje para comprender las condiciones que permiten que las células …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por subvenciones de la Fondazione Bambino Gesù y Ricerca Corrente (Ministerio de Salud italiano) a C.C. Nos gustaría agradecer al Dr. Enrico Bertini (Departamento de Neurociencia, Unidad de Enfermedades Neuromusculares y Neurodegenerativas, Laboratorio de Medicina Molecular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Centro Central de Microscopía Confocal, Laboratorios de Investigación, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) y Roberta Ferretti (Departamento de Oncohematología, Terapia Génica y Celular, Hospital de Investigación Infantil Bambino Gesù) para discusiones científicas y ayuda técnica. Maria Vinci recibió una “beca para niños con cáncer del Reino Unido”.
Materials
| 10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4488 | Tool |
| 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes | Falcon | 352097 | Tool |
| 1x PBS (With Ca2+; Mg2+) | Thermofisher | 14040133 | Medium |
| 1x PBS (without Ca2+; Mg2+) | Euroclone | ECB4004L | Medium |
| 5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile | Corning | 4487 | Tool |
| Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom | Greiner Bio One | 655090 | Support |
| Cell culture plate, 6 well | Costar | 3516 | Support |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose) | Sigma | D5671 | Medium |
| EDTA | Sigma | ED4SS-500g | Reagent |
| Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | Reagent |
| FAST – READ 102 | Biosigma | BVS100 | Tool |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | Medium |
| Fibronectin | Merck | FC010 | Coating |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Reagent |
| H2O | MILLIQ | ||
| Hoechst | Thermofisher | 33342 | Reagent |
| Laminin 521 | Stem Cell Technologies | 77003 | Coating |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | LS25030081 | Reagent |
| Matrigel | Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | 354277 | Coating |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEF) | Life Technologies | A24903 | Coating |
| MTESR1 Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | Medium |
| MTESR1 Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | Medium |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Reagent |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | Reagent |
| Vitronectin | Stem Cell Technologies | 7180 | Coating |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Reagent |
References
- Masotti, A., et al. Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis. Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
- Kleinman, H. K., et al. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. 생화학. 21 (24), 6188-6193 (1982).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195 (2014).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Laperle, A., et al. α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal. Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).
- Albalushi, H., et al. Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells. Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).
- Zhang, D., et al. Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP. Science Signaling. 10 (493), (2017).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).
- Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells. Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).
- Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).
- Braam, S. R., et al. Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).
- Li, J., et al. Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells. Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).
- Prowse, A. B., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media. Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins. 생화학. 193 (1), 295-299 (1981).
- Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain. Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).
- Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system. Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).
- Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).
- Vaheri, A., Mosher, D. F. High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation. Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process. Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).
- Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
- Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix. Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).
- Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Vigilante, A., et al. Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors. Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).
