Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies
Summary
Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.
Abstract
Les maladies rénales touchent plus de 10 % de la population mondiale et coûtent des milliards de dollars en dépenses fédérales. Les formes les plus graves de maladie rénale et éventuellement d’insuffisance rénale terminale sont souvent causées par les dommages aux podocytes glomérulaires, qui sont les cellules épithéliales hautement spécialisées qui fonctionnent avec les cellules endothéliales et la membrane basale glomérulaire pour former la barrière de filtration du rein. Les progrès de la médecine rénale ont été entravés par la disponibilité limitée de tissus primaires et le manque de méthodes robustes pour la dérivation de cellules rénales humaines fonctionnelles, telles que les podocytes. La capacité de dériver des podocytes à partir de sources renouvelables, telles que les cellules souches, pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle des mécanismes du développement et de la maladie des reins humains, ainsi que fournir de nouveaux outils pour la découverte thérapeutique. L’objectif de ce protocole était de développer une méthode pour dériver des podocytes post-mitotiques matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS) avec une efficacité et une spécificité élevées, et dans des conditions chimiquement définies. Les podocytes dérivés des cellules hiPS produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques à la lignée (y compris la néphrine, la podocine et la tumeur de Wilm 1) et présentent les caractéristiques morphologiques spécialisées (y compris les processus primaires et secondaires du pied) associés aux podocytes matures et fonctionnels. Curieusement, ces caractéristiques spécialisées sont notamment absentes dans la lignée cellulaire podocytaire immortalisée largement utilisée dans le domaine, ce qui suggère que le protocole décrit ici produit des podocytes rénaux humains qui ont un phénotype plus mature sur le plan du développement que les lignées cellulaires podocytaires existantes généralement utilisées pour étudier la biologie rénale humaine.
Introduction
Les progrès de la culture de cellules souches pluripotentes humaines sont sur le point de révolutionner la médecine régénérative, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en fournissant aux chercheurs une source renouvelable et évolutive de matériel biologique qui peut être conçue pour obtenir presque n’importe quel type de cellule dans le corps humain1. Cette stratégie est particulièrement utile pour dériver des types de cellules spécialisées et fonctionnelles qui seraient autrement difficiles à obtenir. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS)2,3,4,5 sont particulièrement attrayantes en raison de leur origine cellulaire somatique et du potentiel qu’elles représentent pour la médecine personnalisée. Cependant, le développement de méthodes pour dériver d’autres lignées cellulaires à partir de cellules hiPS reste difficile en raison de l’utilisation fréquente de conditions de culture mal définies, ce qui conduit à une faible efficacité et à une génération non spécifique de populations cellulaires hétérogènes6,7.
Présenté ici est une méthode pour la dérivation de podocytes rénaux matures à partir de cellules hiPS avec spécificité et haute efficacité dans des conditions chimiquement définies. En tenant compte des rôles de multiples facteurs dans le microenvironnement cellulaire, une stratégie de différenciation des cellules souches a été développée qui impliquait l’optimisation des facteurs solubles présentés dans le milieu de culture cellulaire ainsi que des facteurs insolubles, tels que les composants de la matrice extracellulaire ou les substrats adhésifs. Compte tenu de l’importance de la signalisation de l’intégrine dans le développement et la fonction des podocytes, l’expression des récepteurs de l’intégrine à la surface de la cellule a été initialement examinée. Les intégrines β1 étaient fortement exprimées non seulement dans les cellules hiPS, mais aussi dans leurs dérivés, y compris les cellules mésodermiques et les cellules mésodermiques intermédiaires8,9,10. Des expériences ultérieures ont confirmé que les ligands qui se lient aux intégrines β1 (y compris la laminine 511 ou le fragment de laminine 511-E8) soutiennent l’adhésion et la différenciation des cellules hiPS en podocytes lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec les milieux inductifs solubles décrits ci-dessous.
L’induction de l’engagement de la lignée cellulaire a été initiée en confirmant d’abord que les cellules hiPS cultivées sur les surfaces recouvertes de laminine pendant deux jours en présence d’un milieu contenant de l’activine A, chir99021 et Y27632 Inhibiteur de roche peuvent se différencier en cellules qui expriment les marqueurs mésodermiques précoces HAND1, goosecoid et brachyury8,11. Le traitement des cellules du mésoderme pendant 14 jours avec un milieu complété par la protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7) et CHIR99021 a permis la dérivation de cellules mésodermiques intermédiaires qui exprimaient les marqueurs cellulaires néphron-progéniteurs de la tumeur de Wilm 1 (WT1), la protéine apparentée impaire 1 (OSR1)8,11et la protéine 2 du gène de boîte appariée (PAX2)12. Pour obtenir les podocytes glomérulaires rénaux matures, les cellules intermédiaires du mésoderme ont été traitées pendant 4 à 5 jours avec un nouveau milieu composé de BMP-7, d’activine A, de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), d’acide rétinoïque touttrans et de CHIR99021. La cytométrie en flux et l’immunocoloration ont été utilisées pour confirmer que >90% des cellules résultantes présentaient les caractéristiques moléculaires, morphologiques et fonctionnelles du podocyte rénal mature8,11,13. Ces caractéristiques comprennent le développement de processus de pied primaire et secondaire; l’expression de gènes spécifiques à la lignée podocytaire, y compris SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 et l’expression de protéines telles que la podocine, la néphrine et WT114,15,16. En outre, il a été constaté que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent être maintenus en culture jusqu’à quatre semaines in vitro en utilisant un milieu8,11 disponible dans le commerce qui offre une flexibilité supplémentaire dans le calendrier des expériences en aval. Pour plus d’informations concernant les panels de cytométrie en flux utilisés pour déterminer la pureté des podocytes hiPS, veuillez vous référer à notre publication précédente11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour la génération de podocytes glomérulaires rénaux à partir de cellules hiPS. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires associées au phénotype13du podocyte rénal mature. Dans des publications antérieures, nous avons montré que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent imiter la structure et la fonction de filtration sélective du glomérule rénal lorsqu’ils sont co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’école d’ingénierie Pratt de l’Université Duke, la Division de néphrologie de la Duke Medical School, un prix de recherche de chaire du département de médecine de l’Université Duke et un prix spécial de transition de carrière PDEP du Burroughs Wellcome Fund à S.M.. M.B a été soutenu par le programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation. Nous remercions le laboratoire Bursac de nous avoir généreusement fourni la lignée de cellules souches DU11 et le laboratoire Varghese de l’Université Duke d’avoir temporairement partagé leur installation de culture tissulaire avec notre groupe. Cette publication est dédiée à la professeure Laura L. Kiessling, professeure Novartis de chimie au Massachusetts Institute of Technology, à l’époque de son 60e anniversaire.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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