הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית
Summary
מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (>90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.
Abstract
מחלת כליות משפיעה על יותר מ -10% מהאוכלוסייה העולמית ועולה מיליארדי דולרים בהוצאות פדרליות. הצורות החמורות ביותר של מחלת כליות ואי ספיקת כליות סופנית בסופו של דבר נגרמות לעתים קרובות על ידי הנזק לפודוציטים גלומרולריים, שהם תאי האפיתל המיוחדים ביותר המתפקדים יחד עם תאי אנדותל וקרום המרתף הגלומרולרי כדי ליצור את מחסום הסינון של הכליה. ההתקדמות ברפואה הכליתית הופרעה על ידי הזמינות המוגבלת של רקמות ראשוניות והיעדר שיטות חזקות להפקת תאי כליות אנושיים פונקציונליים, כגון פודוקיטים. היכולת להפיק פודוקיטים ממקורות מתחדשים, כגון תאי גזע, יכולה לסייע בקידום ההבנה הנוכחית של מנגנוני התפתחות הכליות והמחלות האנושיות, וכן לספק כלים חדשים לגילוי טיפולי. מטרת פרוטוקול זה הייתה לפתח שיטה להפקת פודוקיטים בוגרים, פוסט-מיטוטיים מתאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם עם יעילות וספציפיות גבוהות, ובתנאים מוגדרים כימית. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS המיוצרים בשיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לשושלת היוחסין (כולל נפרין, פודוקין וגידול 1 של וילם) ומציגים את המאפיינים המורפולוגיים המיוחדים (כולל תהליכי כף הרגל הראשוניים והמשניים) הקשורים לפודוציטים בוגרים ופונקציונליים. באופן מסקרן, תכונות מיוחדות אלה נעדרות באופן בולט בקו התא הפודוקיט המונצח הנמצא בשימוש נרחב בתחום, מה שמצביע על כך שהפרוטוקול המתואר כאן מייצר פודוקיטים של כליות אנושיות שיש להן פנוטיפ בוגר יותר מבחינה התפתחותית מאשר קווי התאים הפודוקיטים הקיימים המשמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה של כליות אנושיות.
Introduction
ההתקדמות בתרבית תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים צפויה לחולל מהפכה ברפואה רגנרטיבית, מידול מחלות וסינון תרופות על ידי מתן מקור מתחדש ומדרגי של חומר ביולוגי שניתן להנדס כדי להשיג כמעט כל סוג תא בגוףהאדם 1. אסטרטגיה זו שימושית במיוחד להפקת סוגי תאים מיוחדים ופונקציונליים שאחרת היה קשה להשיג. תאי גזע פלוריפוטנטים (hiPS) הנגרמים על ידי האדם2,3,4,5 הם אטרקטיביים במיוחד בשל מוצא התא הסומטי שלהם ואת הפוטנציאל שהם מייצגים לרפואה מותאמת אישית. עם זאת, פיתוח שיטות לגזור שושלות תאים אחרות מתאי hiPS נשאר מאתגר בשל השימוש התכוף בתנאי תרבות מוגדרים בצורה גרועה אשר מוביל ליעילות נמוכה ודור לא ספציפי של אוכלוסיות תאים הטרוגניים6,7.
מוצג כאן היא שיטה לגירוש של podocytes כליות בוגרות מתאי hiPS עם ספציפיות ויעילות גבוהה בתנאים מוגדרים כימית. על ידי בחינת התפקידים של גורמים מרובים בתוך microenvironment התא, אסטרטגיית בידול תאי גזע פותחה כי מעורבים אופטימיזציה של גורמים מסיסים המוצגים במדיום תרבית התא, כמו גם גורמים בלתי מסיסים, כגון רכיבי מטריצה חוץ תאית או מצעים דבק. בהתחשב בחשיבות האיתות האינקגרי בהתפתחות ובתפקוד של הפודוקיטה, הביטוי של קולטנים integrin על פני התא נבדק בתחילה. β1 integrins באו לידי ביטוי מאוד לא רק בתאי hiPS, אלא גם בנגזרותיהם כולל mesoderm ותאי mesoderm ביניים8,9,10. ניסויים הבאים אישרו כי ליגנדים שנקשרים לאינטגרינים β1 (כולל למינין 511 או למינין 511-E8) תומכים בהידבקות ובידול של תאי hiPS לפודוציטים כאשר נעשה בהם שימוש בשילוב עם המדיה האינדוקטיבית המסיסה המתוארת להלן.
אינדוקציה של מחויבות שושלת התאים יזמה על ידי אישור תחילה כי תאי hiPS בתרבית על המשטחים מצופים למינין במשך יומיים בנוכחות מדיום המכיל Activin A, CHIR99021, ומעכב סלע Y27632 יכול להבדיל לתאים המבטאים את סמני mesoderm מוקדם HAND1, עור ברווז, brachyury8,11. טיפול בתאי mesoderm במשך 14 ימים עם מדיום בתוספת חלבון מורפוגנטי עצם 7 (BMP-7) ו CHIR99021 אפשר את הנגזרת של תאי mesoderm ביניים שביטא את סמני תא נפרון-אבות גידול 1 (WT1), חלבון קשור דילוג מוזר 1 (OSR1)8,11, ואת הגן תיבת מזווג 2 חלבון (PAX2)12. כדי להפיק את הפודוקיטים הגלומרולריים הבוגרים של הכליות, תאי המסודרם הבינוניים טופלו במשך 4-5 ימים במדיום חדשני המורכב מ- BMP-7, Activin A, גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF), חומצה ריטינואיתטרנסית ו- CHIR99021. ציטומטריית זרימה וחיסון שימשו כדי לאשר כי >90% מהתאים המתקבלים הציגו את המאפיינים המולקולריים, המורפולוגיים והתפקודיים של פודוקייט הכליות הבוגר8,11,13. מאפיינים אלה כוללים התפתחות של תהליכים ראשוניים ומשניים ברגל; הביטוי של גנים ספציפיים לשושלת שושלת פודוקיטים כולל SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 וביטוי של חלבונים כולל פודוקין, נפרין, ו WT114,15,16. בנוסף, נמצא כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS ניתן לשמור בתרבות עד ארבעה שבועות במבחנה באמצעות בינוני זמין מסחרית 8,11 אשר מספקגמישותנוספת בתזמון של ניסויים במורד הזרם. לקבלת מידע נוסף לגבי לוחות ציטומטריית הזרימה המשמשים לקביעת טוהר ה- hiPS-podocytes, עיין בפרסום הקודם שלנו11.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדו”ח זה, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת פודוקיטים גלומרולריים בכליות מתאי hiPS. הפודוקיטים שמקורם בתא hiPS מציגים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות הקשורות לפנוטיפ פודוקיט הכליות הבוגר13. בפרסומים קודמים, הראינו כי פודוקיטים שמקורם בתא hiPS יכולים לחקות את המבנה ואת פונקציית הסינון הסל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר פראט להנדסה באוניברסיטת דיוק, המחלקה לנפרולוגיה בבית הספר לרפואה דיוק, פרס מחקר של יו”ר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת דיוק, ופרס מעבר קריירה PDEP של קרן בורוז וולקום ל- S.M. M.B נתמך על ידי תכנית מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע. אנו מודים למעבדת בורסאק על שסיפקה לנו בנדיבות את קו תאי הגזע DU11, ואת מעבדת ורגזה באוניברסיטת דיוק על שיתוף זמני של מתקן תרבות הרקמות שלהם עם הקבוצה שלנו. פרסום זה מוקדש לפרופ’ לורה ל. קסלינג, פרופסור נוברטיס לכימיה במכון הטכנולוגי של מסצ’וסטס, לרגל יום הולדתה ה-60.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. 발생학. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. 발생학. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
