Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas
Summary
Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.
Abstract
La enfermedad renal afecta a más del 10% de la población mundial y cuesta miles de millones de dólares en gastos federales. Las formas más graves de enfermedad renal y eventual insuficiencia renal en etapa terminal a menudo son causadas por el daño a los podocitos glomerulares, que son las células epiteliales altamente especializadas que funcionan junto con las células endoteliales y la membrana basal glomerular para formar la barrera de filtración del riñón. Los avances en medicina renal se han visto obstaculizados por la limitada disponibilidad de tejidos primarios y la falta de métodos robustos para la derivación de células renales humanas funcionales, como los podocitos. La capacidad de derivar podocitos de fuentes renovables, como las células madre, podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de los mecanismos del desarrollo y la enfermedad renal humana, así como proporcionar nuevas herramientas para el descubrimiento terapéutico. El objetivo de este protocolo era desarrollar un método para derivar podocitos maduros postmitóticos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS) con alta eficiencia y especificidad, y en condiciones químicamente definidas. Los podocitos derivados de células hiPS producidos por este método expresan marcadores específicos del linaje (incluyendo nefrina, podocina y tumor de Wilm 1) y exhiben las características morfológicas especializadas (incluidos los procesos primarios y secundarios del pie) asociadas con podocitos maduros y funcionales. Curiosamente, estas características especializadas están notablemente ausentes en la línea celular de podocitos inmortalizados ampliamente utilizada en el campo, lo que sugiere que el protocolo descrito aquí produce podocitos renales humanos que tienen un fenotipo de desarrollo más maduro que las líneas celulares de podocitos existentes típicamente utilizadas para estudiar la biología del riñón humano.
Introduction
Los avances en el cultivo de células madre pluripotentes humanas están a punto de revolucionar la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos al proporcionar a los investigadores una fuente renovable y escalable de material biológico que puede diseñarse para obtener casi cualquier tipo de célula dentro del cuerpo humano1. Esta estrategia es especialmente útil para derivar tipos de células especializadas y funcionales que de otro modo serían difíciles de obtener. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS)2,3,4,5 son particularmente atractivas debido a su origen celular somático y al potencial que representan para la medicina personalizada. Sin embargo, el desarrollo de métodos para derivar otros linajes celulares a partir de células hiPS sigue siendo un desafío debido al uso frecuente de condiciones de cultivo mal definidas que conducen a una baja eficiencia y a la generación inespecífico de poblaciones de células heterogéneas6,7.
Aquí se presenta un método para la derivación de podocitos renales maduros a partir de células hiPS con especificidad y alta eficiencia en condiciones químicamente definidas. Al considerar los roles de múltiples factores dentro del microambiente celular, se desarrolló una estrategia de diferenciación de células madre que implicó la optimización de factores solubles presentados en el medio de cultivo celular, así como factores insolubles, como componentes de matriz extracelular o sustratos adhesivos. Dada la importancia de la señalización de la integrina en el desarrollo y la función de los podocitos, se examinó inicialmente la expresión de los receptores de integrina en la superficie celular. Las integrinas β1 se expresaron altamente no solo en las células hiPS, sino también en sus derivados, incluidas las células mesodermo y mesodermointermedias 8,9,10. Experimentos posteriores confirmaron que los ligandos que se unen a las integrinas β1 (incluyendo laminina 511 o el fragmento de laminina 511-E8) apoyan la adhesión y diferenciación de las células hiPS en podocitos cuando se usan junto con los medios inductivos solubles que se describen a continuación.
La inducción del compromiso de linaje celular se inició confirmando primero que las células hiPS cultivadas en las superficies recubiertas de laminina durante dos días en presencia de un medio que contiene Activina A, CHIR99021 e Y27632 El inhibidor de roca puede diferenciarse en células que expresan los marcadores tempranos del mesodermo HAND1, goosecoid y brachyury8,11. El tratamiento de las células mesodérmicas durante 14 días con un medio suplementado con proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y CHIR99021 permitió la derivación de células mesodérmicas intermedias que expresaban los marcadores de células progenitoras de nefrona Tumor de Wilm 1 (WT1), proteína relacionada extrañamente omitida 1 (OSR1)8,11y proteína pareada del gen 2 de la caja (PAX2)12. Para derivar los podocitos glomerulares renales maduros, las células mesodérmicas intermedias se trataron durante 4-5 días con un nuevo medio que consiste en BMP-7, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ácido retinoicoall-trans y CHIR99021. Se utilizó la citometría de flujo y la inmunotinción para confirmar que >90% de las células resultantes exhibían las características moleculares, morfológicas y funcionales del podocito renal maduro8,11,13. Estas características incluyen el desarrollo de procesos primarios y secundarios del pie; la expresión de genes específicos del linaje de podocitos, incluidos SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 y la expresión de proteínas como podocina, nefrina y WT114,15,16. Además, se encontró que los podocitos derivados de células hiPS se pueden mantener en cultivo durante un máximo de cuatro semanas in vitromedianteel uso de un medio disponible comercialmente 8,11 que proporciona una flexibilidad adicional en el momento de los experimentos posteriores. Para obtener más información sobre los paneles de citometría de flujo utilizados para determinar la pureza de los hiPS-podocitos, consulte nuestra publicación anterior11.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe, describimos un protocolo para la generación de podocitos glomerulares renales a partir de células hiPS. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben características morfológicas y moleculares asociadas con el fenotipo13de podocitos renales maduros. En publicaciones anteriores, demostramos que los podocitos derivados de células hiPS pueden imitar la estructura y la función de filtración selectiva del glomérulo renal cuando se cocultivan con células endoteliales microva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ingeniería Pratt de la Universidad de Duke, la División de Nefrología de la Escuela de Medicina de Duke, el Premio de Investigación de una Cátedra del Departamento de Medicina de la Universidad de Duke y un Premio Ad Hoc de Transición de Carrera PDEP del Fondo Burroughs Wellcome a S.M. M.B fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Laboratorio Bursac por proporcionarnos generosamente la línea de células madre DU11, y al Laboratorio Varghese de la Universidad de Duke por compartir temporalmente sus instalaciones de cultivo de tejidos con nuestro grupo. Esta publicación está dedicada a la Prof. Laura L. Kiessling, Profesora de Química de Novartis en el Instituto de Tecnología de Massachusetts, en celebración de su 60cumpleaños.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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