Summary
Her beskriver vi forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Under en gradvis og kontrolleret afsavn af serum skildrer disse skiver udviklende epileptiske-lignende begivenheder og kan betragtes som en ex vivo-model af epileptogenese. Dette system repræsenterer et glimrende værktøj til overvågning af dynamikken i spontan aktivitet samt til vurdering af udviklingen af neuroinflammatoriske træk i løbet af epileptogenese.
Abstract
Organotypic skive kulturer er blevet udbredt til model hjernesygdomme og betragtes som fremragende platforme til evaluering af et lægemiddel neurobeskyttende og terapeutiske potentiale. Organotypiske skiver fremstilles af udplantet væv og repræsenterer et komplekst flercellet ex vivo-miljø. De bevarer hjernecellernes tredimensionelle cytoarkitektur og lokale miljø, opretholder neuronale forbindelser og den neuron-glia gensidige interaktion. Hippocampal organotypiske skiver anses for egnede til at udforske de grundlæggende mekanismer i epileptogenese, men klinisk forskning og dyremodeller af epilepsi har antydet, at rhinal cortex, der består af perirhinale og entorhinale cortices, spiller en relevant rolle i anfaldsgenerering.
Her beskriver vi forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Optagelser af spontan aktivitet fra CA3-området under perfusion med komplet vækstmedium, ved fysiologisk temperatur og i mangel af farmakologiske manipulationer viste, at disse skiver skildrer udviklende epileptiske-lignende begivenheder gennem tiden i kulturen. Øget celledød, gennem propidium jod optagelse assay, og gliose, vurderet med fluorescens-koblet immunohistochemistry, blev også observeret. Den eksperimentelle tilgang, der præsenteres, fremhæver værdien af rhinal cortex-hippocampus organotypic skivekulturer som en platform til at studere dynamikken og progressionen af epileptogenese og til at screene potentielle terapeutiske mål for denne hjernepatologi.
Introduction
Epilepsi, en af de mest udbredte neurologiske lidelser på verdensplan, er kendetegnet ved den periodiske og uforudsigelige forekomst af synkroniseret og overdreven neuronal aktivitet i hjernen. På trods af de forskellige antiepileptiske lægemidler (AERD'er), der er tilgængelige, er en tredjedel af patienter med epilepsi ildfaste til terapi1 og fortsætter med at opleve anfald og kognitiv tilbagegang. Desuden hæmmer tilgængelige AED'er kognition på grund af deres relativt generaliserede handlinger på neuronal aktivitet. Epileptogenese er svært at studere hos mennesker, på grund af de mange og heterogene epileptogene skader, lange latente perioder, der varer måneder til årtier, og de vildledende virkninger af antikonvulsiv behandling efter det første spontane anfald.
Identifikation af potentielle terapeutiske midler til behandling af epilepsi er blevet mulig på grund af dyremodeller af epilepsi: 1) genetiske modeller, der anvender genetisk disponerede dyr, hvor anfald forekommer spontant eller som reaktion på en sensorisk stimulus; 2) modeller af elektrisk stimulation-inducerede anfald; og 3) farmakologiske modeller for anfald induktion, der bruger pilocarpin (en muscarinic receptor agonist), kainat (en kainate receptor agonist) eller 4-aminopyridin (en kalium kanal blocker), blandt andre. Disse modeller var afgørende for forståelsen af adfærdsændringerne samt molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for epilepsi, og de har ført til opdagelsen af mange AEDs2.
Ex vivo-præparater er også et effektivt værktøj til at udforske de mekanismer, der ligger til grund for epileptogenese og ictogenese. Akutte hippocampale skiver, som muliggør elektrofysiologiske undersøgelser af levende celler over en 6-12 timers periode, og organotypiske hippocampale skiver, der kan bevares i en inkubator over en periode på dage eller uger, er blevet flittigt brugt i undersøgelser af epileptiform aktivitet3.
Organotypiske hjerneskiver fremstilles af udplantet væv og repræsenterer en fysiologisk tredimensionel model af hjernen. Disse skiver bevarer cytoarchitecture af regionen af interesse og omfatter alle hjerneceller og deres intercellulære kommunikation4. Den mest anvendte region til langsigtede organotypiske kulturer er hippocampus, da denne region er påvirket af neuronalt tab i flere neurodegenerative tilstande. De har været meget brugt til at modellere hjernesygdomme og betragtes som fremragende værktøjer til vurdering af et lægemiddels neurobeskyttende og terapeutiske potentiale5,6. Modeller af epileptogenese, slagtilfælde og Aβ-induceret toksicitet blev beskrevet i hippocampal organotypiske skiver7,8,9,10. Parkinsons sygdom blev udforsket i ventral mesencephalon og striatum, samt cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypic skiver11. Organotypic cerebellar skive kulturer efterligne mange aspekter af axon myelination og cerebellar funktioner og er en udbredt model for at undersøge nye terapeutiske strategier i multipel sklerose12.
Imidlertid har klinisk forskning og dyremodeller af epilepsi antydet, at rhinal cortex, sammensat af perirhinal og entorhinal cortices, spiller en rolle i anfald generation13. Således blev der etableret en model af epileptogenese i rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver14. Under en gradvis og kontrolleret afsavn af serum skildrer rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver udviklende epileptiske-lignende begivenheder, i modsætning til analoge skiver, der altid opbevares i et serumholdigt medium.
I epilepsi, som i mange akutte og kroniske sygdomme i centralnervesystemet, den neurocentriske vision undlader at belyse de mekanismer, der ligger til grund for sygdom debut og progression. Kliniske og eksperimentelle beviser peger på hjernebetændelse, hvor mikroglia og astrocytter spiller en relevant rolle, som en af de vigtigste aktører, der bidrager til den epileptiske proces. Farmakologiske forsøg med dyremodeller af epilepsi tyder på, at antiepileptogenic virkninger kan opnås ved at målrette proinflammatoriske veje, og i dag betragtes neuroinflammation som en ny mulighed for udvikling af terapeutiske tilgange til epilepsi15.
Her beskriver vi grundigt forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus organotypic skivekulturer samt detaljerne til registrering af spontan epileptiform aktivitet fra dem. Vi fremhæver, at dette system efterligner flere neuroinflammatoriske aspekter af epilepsi, idet det således er egnet til at udforske gliacellernes rolle og neuroinflammation i denne patologi. Desuden udgør det en brugervenlig platform til screening af potentielle terapeutiske tilgange til epilepsi.
Protocol
Den portugisiske lovgivning og EU's retningslinjer (2010/63/EU) blev overholdt i alle procedurer vedrørende beskyttelse af dyr til videnskabelige formål. Alle de her beskrevne metoder blev godkendt af iMM's institutionelle dyrevelfærdsorgan (ORBEA-iMM) og den nationale kompetente myndighed (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. Forberedelse af rhinal cortex-hippocampus skiver
BEMÆRK: Forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus skiver bruger P6-7 Sprague-Dawley rotter.
- Kulturopsætning og medium forberedelse
- Dagen før kulturen forberedes de ønskede medier, og de anbringes ved 4 °C.
- Forbered dissektionsmedium: 25 mM glukose i Geys balancerede saltopløsning (GBSS).
- Forbered kulturmedium: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Hesteserum (HS), 25 mM glukose, 30 μg/mL Gentamycin.
- Forbered vedligeholdelsesmedium: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamin, 30 μg/mL Gentamycin, HS (15%, 10%, 5% og 0%).
- Hjernehøst
- Lige før kulturen påbegyndes, tilsættes 1,1 mL dyrkningsmedium til hver brønd på 6-brøndspladen med en P1000-pipette og placeres ved 37 °C.
- Placer alt udstyr (dissektionsmikroskop, vævshelikopter, dissekeringslampe, dissekeringsværktøjer, elektroder, plader, skær og filterpapir) inde i det biologiske sikkerhedsskab og steriliser under UV-lys i 15 minutter.
- Skivetykkelsen justeres til 350 μm.
- Træk GBSS ud af køleskabet. Tilsæt 5 mL GBSS til seks petriskåle. Seks petriskåle vil være påkrævet pr. Dyr.
- Aflive rotte hvalp. Udfør halshugning ved hjælp af en skarp saks i bunden af dyrets hjernestamme.
- Vask dyrets hoved tre gange i koldt GBSS og tag det inde i sikkerhedsskabet.
- Vævsisolering og forberedelse af skiver
- Sæt skarpe pincet i øjenhulerne for at holde hovedet.
- Ved hjælp af en tynd saks skære huden / hovedbunden langs midterlinjen starter fra hvirveldyr foramen mod frontallapperne og læg den til side.
- Skær på samme måde kraniet og langs cerebral tværgående revne (mellemrum mellem hjerne og lillehjernen). Med buede lange pincet, flytte det fra hinanden.
- Kassér de olfaktoriske pærer med en spatel. Fjern hjernen fra hovedet og læg den i iskold GBSS med den dorsale overflade med på hovedet (Figur 1A).
- Sæt de fine pincet i lillehjernen og gå langs midterlinjen med spatel åbning hver halvkugle meget omhyggeligt(Figur 1B).
- Med korte kurve pincet, forsigtigt fjerne det overskydende væv, der dækker hippocampi, uden at røre hippocampal struktur. Så med en spatel, skåret under hver hippocampus (Figur 1C).
- Afhente en halvkugle og placere den, med hippocampus vender op, på et filter papir. Gentag proceduren med den anden halvkugle og placer den parallelt med den første i filterpapiret. Sæt filterpapiret på vævsskrens, med halvkuglerne vinkelret på klingen, og skær halvkuglerne i 350 μm skiver (Figur 1D).
- Læg det skivede væv i en petriskål med kold GBSS(Figur 1E).
- Skærdene adskilles forsigtigt ved hjælp af de runde spidselektroder (Figur 1F). Hold kun skiverne med en strukturelt intakt rhinal cortex og hippocampus. GD og CA-områder bør defineres perfekt, såvel som den entorhinale og perirhinale cortex (figur 1G).
- Placer hver skive på indsatsen (Figur 1H-I), med en spatel og en rund spids elektrode. Fjern overskydende dissektionsmedium omkring hver skive med en P20-pipette (Figur 1J). Fire rhinal cortex-hippocampus skiver kan dyrkes i et enkelt indlæg (Figur 1K).
- Vedligeholdelse af kultur
- Skift mediet hver anden dag.
- Mediet opvarmes ved 37 °C.
- Tag pladerne fra inkubatoren. Hver indsats opskær ved at holde plastkanten med tang(Figur 1L).
- Brug en fri hånd til at suge mediet fra brønden. Sæt indsatsen tilbage i brønden og tilsæt 1 mL, med en P1000 pipette, af frisk opvarmet medium (Figur 1M). Gentag dette for alle skær. Sørg for, at der ikke er luftbobler mellem membranen og mediet.
BEMÆRK: Epileptiske skiver gennemgår en gradvis og kontrolleret afsavn af serum i mediet. Fra 9 Days In Vitro (DIV) på, skiver opretholdes i NBA uden HS14.
Figur 1: Detaljeret procedure for fremstilling af rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. (A) Fjern hjernen fra hovedet og læg den i iskold GBSS med dorsaloverfladen i øjnene. (B) Sæt tangen i lillehjernen. Åbn hjernen gennem midterlinjen og fjern det overskydende væv over hippocampus. (C) Med en spatel skåret under hippocampus, som angivet med pilene. D) Placer både hippocampi med udsigt over og parallelt med hinanden på filterpapiret, og skær 350 μm skiver på vævshelikopteren. (E)Placer den skivede hippocampus i iskold GBSS. (F) Adskil skiverne ved hjælp af runde spidse glaselektroder. (G) Vælg kun de skiver, der skildrer en intakt rhinal cortex og hippocampus. (H, I) Ved hjælp af en rund spids glaselektrode skubbes hver skive til spatelen og læg den på indsatsen. (J) Fjern gbss omkring skiven. (K) Placer fire udsnit pr. skær. (L) For at skifte mediet skal du løfte indsatsen og suge mediet med en glaspipette. (M) Tilsæt frisk medium ved at placere pipetten mellem indsatsen og væggene i 6-brønde plade. Sørg for, at der ikke er luftbobler under skiverne. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Elektrofysiologiske optagelser
BEMÆRK: Elektrofysiologiske optagelser blev udført i rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver ved 7, 14 og 21 DIV i et interface-type kammer. Optagelser blev opnået med en forstærker, digitaliseret og analyseret med software. Alle optagelser blev filtreret med båndpas (ottepolet Bessel-filter ved 60 Hz og gaussisk filter ved 600 Hz).
- Forberedelse af installation
- Forbered 50 mL NBA-medium med 1 mL B27 og 250 μL L-glutamin. Varm op ved 37 °C.
- Indstil elektrofysiologiopsætningen i tæt kredsløb. Kontroller, om strømningshastigheden er 2 mL/min.
- Åbn carbox (5% CO2/95% O2) ventil og kontrollere vandstanden i systemet.
- Sæt filterpapiret i interfacets optagekammer for at dræne overskydende medium og linsens rengøringspapir under rammen for at levere medium til skiven.
- Tænd for temperaturregulatoren, forstærkerne og mikromanipulatoren.
- Temperaturen i grænsefladekammeret stabiliseres ved 37 °C, inden optagelserne påbegyndes.
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glukose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 med pH 7.4) og brug den til at fylde glaselektroden med en sprøjte. Placer den i den modtagende elektrode.
- Optagelser af spontan aktivitet
- Når temperaturen er stabil, skal du fjerne pladen fra inkubatoren og skære en skive fra indsatsen med et meget skarpt blad. Placer den i en 60 mm plade med en dråbe medium. Tag det til interface optagelse kammer.
- Placer skiven i grænsefladekammeret med hippocampus nederst til højre. Placer den modtagende elektrode i CA3 pyramidecellelaget.
- Fortsæt til den kontinuerlige erhvervelsesprotokol og optag i 30 min.
3. PI optagelse analyse
BEMÆRK: Celledød blev vurderet ved at overvåge den cellulære optagelse af det fluorescerende farvestof propidium jod (PI). PI er en polær forbindelse, som kommer ind i celler med beskadigede cellemembraner og interagerer med DNA, der udsender rød fluorescens (absorbans 493 nm, emission 630 nm). Da PI ikke er gennemtrængelige for levende celler, bruges det til at detektere døde celler i en population.
- PI inkubation
- Forbered, i kultur medium, en frisk 1:10 fortynding af PI lager.
- For PI optagelse assay fjerne pladen fra inkubatoren og forsigtigt hæve indsatsen. Der tilsættes 13 μL PI til mediet med en P20-pipette, der opnår en endelig koncentration på 2 μM. Omrør langsomt pladen, før indsatsen sættes tilbage på plads. Sørg for, at der ikke er bobler under skiverne.
- Skiverne anbringes i inkubatoren på 37 °C i 2 timer.
- Fortsæt med immunhisokemiprotokollen, som beskrevet i næste afsnit. Dæk pladerne med aluminium, da PI er lysfølsom.
4. Immunohistochemistry
BEMÆRK: I immunohistochemistry blev et neuronspecifikt antistof samt antistoffer, der var i stand til at diskriminere hvilende og reaktive fænotyper af mikroglia og astrocytter, brugt til at evaluere omfanget af neuronal død og gliose i rhinal cortex-hippocampus epileptiske-lignende organotypiske skiver.
- Vævsfiksering
- Fjern pladen fra inkubatoren og indsug mediet. Fastgør skiverne med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved RT ved at tilføje 1 mL PFA under og over skiverne med en P1000 pipette.
- Fjern PFA og tilsæt 1 mL PBS. Tilføj også PBS under og over skiverne.
- Skiverne opbevares ved 4 °C i PBS, indtil de anvendes yderligere. Sæt altid parafilm rundt om pladerne for at undgå tørring.
- Immunostaining trin
- Vask to gange, 10 min hver gang, med 1 mL PBS.
- Forbered permeabiliserings-/blokeringsopløsning, der indeholder 1% Triton-X100, 10% HS og 10% BSA i PBS. Forbered 5% BSA-løsning.
- Tegn to rektangler med den hydrofobe pen (Figur 2A). Skær skiverne ud af indsatsen (Figur 2B) med et meget skarpt blad. Sæt to skiver pr. dias (Figur 2C) og tilsæt 140 μL permeabiliserings-/blokeringsopløsning øverst på hver skive ved hjælp af en P200-pipette. Inkuber i 3 timer på RT.
- De primære antistoffer fortyndes til den arbejdende fortynding i 5% BSA i PBS. Inkuber med de primære antistoffer natten over ved 4 °C.
- Inkuber med de sekundære antistoffer i 4 timer ved RT. Fra dette trin skal du beskytte pladen mod lys, da fluorophorer arbejdes med.
- Placer en 50 μL dråbe Hoechst opløsning på toppen af hver skive og inkuber i 20 min ved RT.
- Vask mellem inkubationer. Vask altid tre gange i 10 minutter hver gang med PBS-T.
- Fjern Hoechst og vask som anbefalet.
- Der tilsættes 50 μL monteringsmedium oven på hver skive. Dæk med en glasovertræksdæksel og surround med neglelak (Figur 2D).
- Lad det tørre ved RT i 24 timer.
- Visualiser immunostaining under et konfokalt mikroskop. Hold de farvede skiver ved -20 °C.
Figur 2: Særlig procedure for immunhistokemisterianalysen. (a)Med den hydrofobe pen trække to firkanter i diaset. (B) Skær det stykke skær, der indeholder skiven. (C) Placer hver skive i kvadraterne trukket med hydrofobisk pen og start permeabilisering / blokering trin. (D) Når protokollen er afsluttet, afsluttes den ved at montere skiverne i monteringsmediet, dække med en glasskær og omgive den med neglelak. Klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Baseret på tidligere beskrivelser af epileptisk signalanalyse i organotypiske hippocampale skiver defineres interictal epileptiformudladninger her som paroxysmale udledninger, der klart adskiller sig fra baggrundsaktivitet med en pludselig ændring i polaritet og forekommer ved lav frekvens (<2 Hz). Paroxysmale udledninger, der varer mere end 10 s og forekommer ved højere frekvens (≥2 Hz), karakteriseres som i ictal epileptiform aktivitet. Hvis en ictal begivenhed indtræffer inden for 10 s efter den foregående, betragtes disse to begivenheder som kun en i ictal begivenhed.
Rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver på 7 DIV (Figur 3A) skildrer blandet interictal og ictal-lignende aktivitet. Ved 14 DIV (Figur 3B) er spontan aktivitet karakteriseret ved i ictal udledninger, som udvikler sig til en overvældende ikt-aktivitet på 21 DIV, med ikt-begivenheder, der varer >1 min.
Figur 3: Spontan epileptiform aktivitet af rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Repræsentative elektrografiske anfaldslignende hændelser, der er registreret fra CA3-området i et kammer af grænsefladetypen, efter (A) 7 DIV, (B) 14 DIV og (C) 21 DIV. Beslaglæggelsesoplysningerne er vist i lavere spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
PI optagelsesanalyse efterfulgt af immunohistochemistry mod neuronal markør NeuN med henblik på at identificere neuronal død. PI optagelse af granulære og pyramideformede neuroner blev observeret i 7 DIV skiver (pile i figur 4A), men antallet af PI+ neuroner steg ved 14 DIV (pile i figur 4B), hvilket bekræfter en øget neuronal død med epileptogenese progression.
Figur 4: Repræsentative billeder af NeuN og PI farvede rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Billeder af NeuN farvede modne neuroner og PI-positive celler blev erhvervet på (A) 7 DIV og (B) 14 DIV, på en konfokal lasermikroskop med en 20x mål. Forstørrede billeder af de stiplede områder vises. Pile peger på døden neuroner (i orange). Skala-bar, 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
En dobbelt farvning af Iba1, sammen med CD68, blev brugt til at evaluere microglia fænotype. Iba1 er en mikroglia/makrofager markør, mens CD68 er et lysosomalt protein udtrykt i høje niveauer af reaktive mikroglia og i lave niveauer ved at hvile microglia. Ved 7 DIV-skiver er forgrenede mikroglia med et lavt CD68-udtryk (pile i figur 5A)mere rigelige end Iba1+/CD68+ reaktiv mikroglia (pilespidser i figur 5A), mens der ved 14 DIV, I alle områder af hippocampus overstiger Iba1+/CD68+ busket/amoeboid M1 microglia (pilespidserne i figur 5B) mikroglia med et lavt CD68-udtryk (pile i figur 5B). Ved 14 DIV kan nogle Iba1+/CD68+ celler med et hyperforgreningsudseende lokaliseres (åbne pilespidser i figur 5B), hvilket kan tyde på forekomsten af M2 antiinflammatorisk fænotype af mikroglia. Dette spørgsmål kræver imidlertid yderligere undersøgelser.
Nylige undersøgelser viste, at forskellige indledende CNS-skader kan fremkalde mindst to typer reaktive astrocytter, A1 og A2, hvor A1-astrocytter er neurotoksiske16. A1-undertypen astrocytter er kendetegnet ved et øget udtryk for komplement C316,17,18. Komplement C3, som spiller en central rolle i aktiveringen af komplementsystemet, genererer C3b, som yderligere nedbrydes til iC3b, C3dg og C3d19. Således blev der anvendt en dobbelt farvning af GFAP og C3d til at vurdere astrogliose. Ved 7 DIV kan udtrykket C3D næppe påvises (Figur 6A), mens der i 14 DIV-skiver kan observeres hypertrofiskE GFAP+/C3d+ astrocytter (pilespidser i figur 6B), hvilket tyder på en progressiv aktivering af A1-astrocytter.
Resultaterne viser en gradvis aktivering af mikroglia og astrocytter i løbet af epileptogenese, efterligner de begivenheder, der er beskrevet hos patienter med epilepsi og i dyremodeller af denne patologi.
Figur 5: Repræsentative billeder af Iba1 og CD68 farvede rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Billeder af Iba1 og CD68 farvede mikroglia, og Hoechst farvede kerner, blev erhvervet på (A) 7 DIV og (B) 14 DIV, på en konfokal laser mikroskop med en 20x mål. Forstørrede billeder af de stiplede områder vises. Pile peger på Iba1+/ CD68- hvile mikroglia, pilespidser angiver Iba1+/ CD68+ busket / amoeboid microglia og åbne pilespidser afslører Iba1+/ CD68+ hyper-forgrenet microglia. Skala-bar, 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative billeder af GFAP og C3d farvede rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Billeder af GFAP og C3d farvede astrocytter, og Hoechst farvede kerner, blev erhvervet på (A) 7 DIV og (B) 14 DIV, på en konfokal laser mikroskop med en 20x mål. Forstørrede billeder af de stiplede områder vises. Pilespidserne peger på GFAP+/C3d+ reaktive A1-astrocytter (med gult). Skala-bar, 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dyremodeller af epilepsi har været afgørende for opdagelsen af mange AID'er, men de kræver mange dyr, og de fleste af dem er tidskrævende på grund af den latente periode for anfaldsdeponeret. Den lave magnesiuminduktion af epileptiformaktivitet i hippocampale akutte skiver er også blevet grundigt revideret i litteraturen3, men akutte skiver har en levedygtighed på 6-12 timer, hvilket gør det umuligt at vurdere langsigtede ændringer. Organotypiske skiver kan opretholdes i kultur fra dage til uger, hvilket gør det muligt at overvinde den korte levedygtighedstid for akutte skiver, og modeller af epileptogenese i organotypiske hippocampale skiver er blevet foreslået3,7,8.
Her beskriver vi forberedelsen af organotypiske skiver, der består af rhinal cortex og hippocampus. Disse skiver tager 15-20 minutter at forberede pr. Dyr, startende fra dyreofring indtil placering af skiver på indsatserne, og 6-8 skiver pr. Halvkugle kan opnås. Der skal udvises ekstra forsigtighed, når halvkuglen åbnes for at eksponere hippocampus, og når vævet fjernes fra filterpapiret efter udskæring. Overskydende væv over hippocampus kan også kompromittere skiven integritet under udskæring.
Rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver skildrer en udviklende epileptisk-lignende aktivitet, der ligner in vivo epilepsi. Efter en uge i kultur skildrer de fleste skiver blandet interictal og i ictal-lignende aktivitet, som udvikler sig til udelukkende i ictal-lignende begivenheder med tiden i kulturen. Indtil videre har vi registreret få interictal udledninger i skiver med 2-3 uger. I dette system, epileptisk-lignende aktivitet synes at udvikle sig hurtigere end i organotypiske hippocampal skiver. Dette kan tilskrives tilstedeværelsen af rhinal cortex, som bevarer det meste af det funktionelle input til hippocampus. For fuldt ud at løse dette problem udføres der i øjeblikket en fuldstændig karakterisering af de epileptiske signaler, der vises af disse skiver gennem tiden i kulturen, såsom antallet og varigheden af i ictle begivenheder sammen med deres amplitude og frekvens.
Dette system kan opretholdes i kultur i mere end tre uger og efterligner mange molekylære korrelater af epilepsi, såsom neuronal død, aktivering af mikroglia og astrocytter og øget produktion af proinflammatoriske cytokiner14, hvilket muliggør en langsigtet karakterisering af disse aspekter. Det repræsenterer også en brugervenlig screeningsplatform, hvor farmakologiske indgreb rettet mod specifikke cellulære veje kan implementeres, og potentielle terapeutiske mål kan testes. Utvivlsomt kan systemet heri præsenteret bidrage til yderligere at oplyse mekanismerne i epileptogenese.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Bioimaging Unit of Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, for alle forslag vedrørende billederhvervelse.
Dette projekt har modtaget støtte fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) gennem projekt PTDC/MEDFAR/30933/2017 og Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A.
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
