Summary
Qui descriviamo la preparazione di fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. Sotto una graduale e controllata privazione del siero, queste fette raffigurano eventi epilettici in evoluzione e possono essere considerate un modello ex vivo di epileptogenesi. Questo sistema rappresenta un ottimo strumento per monitorare la dinamica dell'attività spontanea, nonché per valutare la progressione delle caratteristiche neuroinfiammatorie durante tutto il corso dell'epileptogenesi.
Abstract
Le colture di fette organotipiche sono state ampiamente utilizzate per modellare i disturbi cerebrali e sono considerate eccellenti piattaforme per valutare il potenziale neuroprotettivo e terapeutico di un farmaco. Le fette organotipiche sono preparate da tessuti esimpiantati e rappresentano un complesso ambiente ex vivo multicellulare. Preservano la citoarchitettura tridimensionale e l'ambiente locale delle cellule cerebrali, mantengono la connettività neuronale e l'interazione reciproca neurone-glia. Le fette organotipiche ippocampali sono considerate idonee ad esplorare i meccanismi di base dell'epileptogenesi, ma la ricerca clinica e i modelli animali dell'epilessia hanno suggerito che la corteccia renale, composta da cortici perichinali ed entorinali, gioca un ruolo rilevante nella generazione di convulsioni.
Qui descriviamo la preparazione di fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. Registrazioni di attività spontanea dall'area CA3 sotto perfusione con mezzo di crescita completo, a temperatura fisiologica e in assenza di manipolazioni farmacologiche, hanno mostrato che queste fette raffigurano eventi epilettici in evoluzione nel tempo in coltura. È stata osservata anche l'aumento della morte cellulare, attraverso il test di assorbimento dello ioduro propidio, e la gliosi, valutata con immunoistochimica accoppiata alla fluorescenza. L'approccio sperimentale presentato evidenzia il valore delle colture di fette organotipiche corteccia-ippocampo rhinal come piattaforma per studiare la dinamica e la progressione dell'epileptogenesi e per migliorare potenziali obiettivi terapeutici per questa patologia cerebrale.
Introduction
L'epilessia, uno dei disturbi neurologici più diffusi in tutto il mondo, è caratterizzata dall'insorgenza periodica e imprevedibile di attività neuronale sincronizzata ed eccessiva nel cervello. Nonostante i vari farmaci antiepilettici (AED) disponibili, un terzo dei pazienti con epilessia è refrattario alla terapia1 e continua a sperimentare convulsioni e declino cognitivo. Inoltre, gli AED disponibili ostacolano la cognizione a causa delle loro azioni relativamente generalizzate sull'attività neuronale. L'epileptogenesi è difficile da studiare nell'uomo, a causa delle lesioni epileptogeniche multiple ed eterogenee, dei lunghi periodi latenti che durano da mesi a decenni e degli effetti fuorvianti del trattamento anticonvulsivante dopo la prima crisi spontanea.
L'identificazione di potenziali agenti terapeutici per il trattamento dell'epilessia è diventata possibile grazie a modelli animali di epilessia: 1) modelli genetici, che utilizzano animali geneticamente predisposti in cui le convulsioni avvengono spontaneamente o in risposta a uno stimolo sensoriale; 2) modelli di convulsioni indotte dalla stimolazione elettrica; e 3) modelli farmacologici di induzione convulsioni che usano pilocarpina (un agonista del recettore muscarinico), kainato (un agonista del recettore kainato) o 4-amminopiridina (un bloccante del canale del potassio), tra gli altri. Questi modelli sono stati cruciali nella comprensione dei cambiamenti comportamentali, così come dei meccanismi molecolari e cellulari alla base dell'epilessia, e hanno portato alla scoperta di molti AED2.
I preparati ex vivo sono anche un potente strumento per esplorare i meccanismi alla base dell'epileptogenesi e dell'ictogenesi. Le fette ippocampali acute, che consentono studi elettrofisiologici sulle cellule viventi per un periodo di 6-12 ore, e le fette ippocampali organotipiche che possono essere conservate in un'incubatrice per un periodo di giorni o settimane sono state ampiamente utilizzate negli studi sull'attività epileptiforme3.
Le fette cerebrali organotipiche sono preparate da tessuti esimpiantati e rappresentano un modello tridimensionale fisiologico del cervello. Queste fette preservano la citoarchitettura della regione di interesse e includono tutte le cellule cerebrali e la loro comunicazione intercellulare4. La regione più utilizzata per le colture organotipiche a lungo termine è l'ippocampo, poiché questa regione è influenzata dalla perdita neuronale in molteplici condizioni neurodegenerative. Sono stati ampiamente utilizzati per modellare i disturbi cerebrali e sono considerati strumenti eccellenti per valutare il potenziale neuroprotettivo e terapeutico di unfarmaco 5,6. Modelli di epileptogenesi, ictus e tossicità indotta da Aβ sono stati descritti nelle fette organotipiche ippocampali7,8,9,10. Il morbo di Parkinson è stato esplorato nel mesencefalo ventrale e nello striato, così come nel cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, fette organotipiche11. Le colture di fette cerebellari organotipiche imitano molti aspetti della mielinazione degli assoni e delle funzioni cerebellari e sono un modello diffuso per indagare nuove strategie terapeutiche nella sclerosi multipla12.
Tuttavia, la ricerca clinica e i modelli animali dell'epilessia hanno suggerito che la corteccia renale, composta da cortici perihinali ed entorinali, gioca un ruolo nella generazione di convulsioni13. Così, è stato stabilito un modello di epileptogenesi nelle fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo14. Sotto una graduale e controllata privazione del siero, le fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo raffigurano eventi epilettici in evoluzione, a differenza di fette analoghe sempre conservate in un mezzo contenente siero.
Nell'epilessia, come in molte malattie acute e croniche del sistema nervoso centrale, la visione neurocentrica non riesce a chiarire i meccanismi alla base dell'insorgenza e della progressione della malattia. Le evidenze cliniche e sperimentali indicano l'infiammazione cerebrale, in cui microglia e astrociti svolgono un ruolo rilevante, come uno dei principali attori che contribuiscono al processo epilettico. Esperimenti farmacologici su modelli animali di epilessia suggeriscono che gli effetti antiepileptogenici possono essere raggiunti prendendo di mira le vie pro-infiammatorie, e oggi la neuroinfiamminazione è considerata una nuova opzione per lo sviluppo di approcci terapeutici per l'epilessia15.
Qui, descriviamo accuratamente la preparazione delle colture organotipiche della corteccia renale-ippocampo, così come i dettagli per registrare l'attività epileptiforme spontanea da loro. Sottolineiamo che questo sistema imita diversi aspetti neuroinfiammatori dell'epilessia, essendo quindi adatto ad esplorare il ruolo delle cellule gliali e della neuroinfiamminazione in questa patologia. Inoltre, rappresenta una piattaforma facile da usare per lo screening di potenziali approcci terapeutici per l'epilessia.
Protocol
Il diritto portoghese e gli orientamenti dell'Unione europea (2010/63/UE) sono stati rispettati in tutte le procedure relative alla protezione degli animali a fini scientifici. Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Organismo istituzionale per il benessere degli animali (ORBEA-iMM) dell'iMM e dall'autorità nazionale competente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. Preparazione di fette di corteccia-ippocampo renale
NOTA: La preparazione di fette di corteccia renale-ippocampo utilizza ratti P6-7 Sprague-Dawley.
- Impostazione della cultura e preparazione media
- Il giorno prima della coltura, preparare i supporti richiesti e posizionarli a 4 °C.
- Preparare il mezzo di dissezione: 25 mM di glucosio nella soluzione di sale bilanciato (GBSS) di Gey.
- Preparare il terreno di coltura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Siero di Cavallo (HS), 25 mM glucosio, 30 μg/mL Gentamicina.
- Preparare il mezzo di manutenzione: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutammina, 30 μg/mL Gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%).
- Raccolta del cervello
- Poco prima di iniziare la coltura, aggiungere 1,1 mL di mezzo di coltura ad ogni pozzo della piastra a 6 potte con pipetta P1000 e posizionarlo a 37 °C.
- Posizionare tutte le apparecchiature (microscopio a dissezione, elicottero tissutale, lampada di sezionamento, utensili di sezionatura, elettrodi, piastre, inserti e carte filtranti) all'interno dell'armadio di sicurezza biologico e sterilizzare sotto la luce UV per 15 minuti.
- Regolare lo spessore della fetta a 350 μm.
- Ritirare il GBSS dal frigo. Aggiungere 5 mL di GBSS a sei piastre di Petri. Saranno necessari sei piatti petri per animale.
- Eutanasia il cucciolo di topo. Eseguire la decapitazione usando una forbice affilata alla base del tronco encefalico dell'animale.
- Lavare la testa dell'animale tre volte in GBSS freddo e prenderla all'interno dell'armadio di sicurezza.
- Isolamento tissutale e preparazione delle fette
- Inserire saldamente forcep affilate nelle orbite degli occhi per tenere la testa.
- Usando una forbice sottile tagliare la pelle / cuoio capelluto lungo la linea mediana a partire dal forame vertebrale verso i lobi frontali e metterlo da parte.
- Tagliare allo stesso modo il cranio e lungo la fessura trasversale cerebrale (spazio tra cervello e cervelletto). Con le lunghe forcep curve, allontanalo.
- Scartare i bulbi olfattivi con una spatola. Rimuovere il cervello dalla testa e posizionarlo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale di fronte (Figura 1A).
- Inserire le forcep sottili nel cervelletto e percorrere la linea mediana con la spatola che apre ogni emisfero con molta attenzione(Figura 1B).
- Con forcelle curve corte, rimuovere con cura il tessuto in eccesso che copre gli ippocampi, senza toccare la struttura ippocampale. Quindi, con una spatola, tagliare sotto ogni ippocampo(Figura 1C).
- Prendi un emisfero e posizionalo, con l'ippocampo rivolto verso l'alto, su una carta da filtro. Ripetere la procedura con l'altro emisfero e posizionarla parallelamente alla prima, nella carta filtrante. Mettere la carta filtrante sull'elicottero tissutale, con gli emisferi perpendicolari alla lama, e tagliare gli emisferi in fette da 350 μm(Figura 1D).
- Posizionare il tessuto affettato in una piastra di Petri con GBSS freddo (Figura 1E).
- Separare accuratamente le fette utilizzando gli elettrodi a punta rotonda(Figura 1F). Conservare solo le fette con una corteccia rinale strutturalmente intatta e ippocampo. Le aree DG e CA dovrebbero essere perfettamente definite, così come la corteccia entorinale e perichinale(figura 1G).
- Posizionare ogni fetta sull'inserto(Figura 1H-I), con una spatola e un elettrodo a punta rotonda. Rimuovere il mezzo di dissezione in eccesso intorno a ogni fetta con una pipetta P20 (Figura 1J). Quattro fette rhinal cortex-ippocampo possono essere coltivate in un unico inserto (Figura 1K).
- Manutenzione della cultura
- Cambia il mezzo a giorni dall'altra.
- Riscaldare il mezzo a 37 °C.
- Prendi i piatti dall'incubatrice. Raccogliere ogni inserto tenendo il bordo di plastica con le forcep(Figura 1L).
- Utilizzare una mano libera per aspirare il mezzo dal pozzo. Riposizionare l'inserto nel pozzo e aggiungere 1 mL, con una pipetta P1000, di mezzo fresco riscaldato(Figura 1M). Ripetere per tutti gli inserti. Assicurarsi che nessuna bolla d'aria sia intrappolata tra la membrana e il mezzo.
NOTA: Le fette epilettiche subiscono una graduale e controllata privazione del siero nel mezzo. Da 9 giorni in vitro (DIV) in su, le fette vengono mantenute in NBA senza HS14.
Figura 1: Procedura dettagliata per la preparazione delle fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. (A) Rimuovere il cervello dalla testa e posizionarelo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale di fronte. (B) Inserire le forcep nel cervelletto. Aprire il cervello attraverso la linea mediana e rimuovere il tessuto in eccesso sopra l'ippocampo. (C) Con una spatola tagliata sotto l'ippocampo, come indicato dalle frecce. (D) Posizionare entrambi gli ippocampi rivolti verso l'alto e paralleli l'uno all'altro sulla carta filtrante e tagliare 350 μm di fette sull'elicottero tissutale. (E) Posizionare l'ippocampo affettato in GBSS ghiacciato. (F) Separare le fette con l'aiuto di elettrodi di vetro a punta rotonda. (G) Scegli solo le fette che raffigurano una corteccia rinale intatta e un ippocampo. (H, I) Con l'aiuto di un elettrodo di vetro rotondo a punta spingere ogni fetta sulla spatola e posizionarla sull'inserto. (J) Rimuovere il GBSS che circonda la sezione. (K) Posizionare quattro fette per inserto. (L) Per cambiare il mezzo, sollevare l'inserto e aspirare il mezzo con una pipetta di vetro. (M) Aggiungere un mezzo fresco posizionando la pipetta tra l'inserto e le pareti della piastra a 6 pozzatti. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria sotto le fette. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Registrazioni elettrofisioiche
NOTA: Le registrazioni elettrofisiotiche sono state eseguite in fette organotipiche corteccia-ippocampo rhinal a 7, 14 e 21 DIV in una camera di tipo interfaccia. Le registrazioni sono state ottenute con un amplificatore, digitalizzate e analizzate con software. Tutte le registrazioni erano filtrate a banda (filtro bessel a otto poli a 60 Hz e filtro gaussiano a 600 Hz).
- Preparazione dell'installazione
- Preparare 50 mL di mezzo NBA con 1 mL di B27 e 250 μL di L-glutammina. Riscaldarsi a 37 °C.
- Impostare la configurazione dell'elettrofisiologia in circuito chiuso. Verificare se la portata è di 2 mL/min.
- Aprire la valvola carbox (5% CO2/95% O2) e controllare il livello dell'acqua nel sistema.
- Mettere la carta filtrante nella camera di registrazione dell'interfaccia per drenare il mezzo in eccesso e la carta per la pulizia dell'obiettivo sotto il telaio per fornire il mezzo alla fetta.
- Accendere il regolatore di temperatura, gli amplificatori e il micromanipolatore.
- Lasciare che la temperatura nella camera di interfaccia si stabilizzi a 37 °C prima di iniziare le registrazioni.
- Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 con pH 7,4) e utilizzarlo per riempire l'elettrodo di vetro con una siringa. Posizionarlo nell'elettrodo ricevente.
- Registrazioni di attività spontanea
- Una volta che la temperatura è stabile, rimuovere la piastra dall'incubatore e tagliare una fetta dall'inserto con una lama altamente affilata. Posizionarlo in una piastra da 60 mm con una goccia di mezzo. Portalo alla camera di registrazione dell'interfaccia.
- Posizionare la fetta nella camera di interfaccia con l'ippocampo in basso a destra. Posizionare l'elettrodo ricevente nello strato cellulare piramidale CA3.
- Procedere al protocollo di acquisizione continua e registrare per 30 min.
3. Dosaggio dell'assorbimento PI
NOTA: La morte cellulare è stata valutata monitorando l'assorbimento cellulare dello ioduro di propidio colorante fluorescente (PI). PI è un composto polare, che entra in cellule con membrane cellulari danneggiate e interagisce con il DNA emettendo fluorescenza rossa (assorbanza 493 nm, emissione 630 nm). Poiché PI non è permeante per le cellule vive, viene utilizzato per rilevare le cellule morte in una popolazione.
- Incubazione PI
- Preparare, nel terreno di coltura, una fresca diluizione 1:10 dello stock PI.
- Per il test di assorbimento PI rimuovere la piastra dall'incubatore e sollevare con cura l'inserto. Aggiungere 13 μL di PI al mezzo, con una pipetta P20, ottenendo una concentrazione finale di 2 μM. Agitare lentamente la piastra prima di rimettere l'inserto in posizione. Assicurati che non ci siano bolle sotto le fette.
- Rimettere le fette nell'incubatore a 37 °C per 2 ore.
- Procedere con il protocollo immunoistochimica, come descritto nella sezione successiva. Coprire le piastre con alluminio, poiché PI è sensibile alla luce.
4. Immunoistochimica
NOTA: Nell'immunoistochimica sono stati utilizzati un anticorpo specifico neuronale, nonché anticorpi in grado di discriminare fenotipi a riposo e reattivi di microglia e astrociti, per valutare l'estensione della morte neuronale e della gliosi nelle fette organotipiche simili alla corteccia rinale-ippocampo.
- Fissazione dei tessuti
- Rimuovere la piastra dall'incubatore e aspirare il mezzo. Fissare le fette con paraformaldeide al 4% (PFA) per 1 h a RT, aggiungendo 1 mL di PFA sotto e sopra le fette, con una pipetta P1000.
- Rimuovere il PFA e aggiungere 1 mL di PBS. Aggiungere anche PBS sotto e sopra le fette.
- Mantenere le fette a 4 °C, in PBS, fino a un ulteriore utilizzo. Mettere sempre il parafilm intorno alle piastre per evitare l'asciugatura.
- Fasi di immunosottenzione
- Lavare due volte, 10 minuti ogni volta, con 1 mL di PBS.
- Preparare la soluzione di permeabilizzazione/blocco contenente 1% Triton-X100, 10% HS e 10% BSA in PBS. Preparare la soluzione BSA al 5%.
- Disegnare due rettangoli con la penna idrofobica (Figura 2A). Tagliare le fette dall'inserto (Figura 2B) con una lama molto affilata. Mettere due fette per diapositiva (Figura 2C) e aggiungere 140 μL di soluzione di permeabilizzazione/blocco sulla parte superiore di ogni fetta, utilizzando una pipetta P200. Incubare per 3 ore presso RT.
- Diluire gli anticorpi primari alla diluizione di lavoro nel 5% di BSA in PBS. Incubare con gli anticorpi primari durante la notte a 4 °C.
- Incubare con gli anticorpi secondari per 4 ore a RT. Da questo passaggio, proteggere la piastra dalla luce poiché si stanno lavorando fluorofori.
- Posizionare una goccia di 50 μL di soluzione hoechst sulla parte superiore di ogni fetta e incubare per 20 minuti a RT.
- Lavare tra le incubazioni. Lavare sempre tre volte, per 10 minuti ogni volta, con PBS-T.
- Rimuovere Hoechst e lavare come raccomandato.
- Aggiungere 50 μL di mezzo di montaggio sulla parte superiore di ogni fetta. Coprire con un copriscivolo in vetro e circondarlo con smalto (Figura 2D).
- Lasciare asciugare a RT per 24 ore.
- Visualizza l'immunostaining al microscopio confocale. Mantenere le fette macchiate a -20 °C.
Figura 2: Procedura specifica per il saggio di immunoistochimica. (A) Con la penna idrofobica disegnare due quadrati nello scivolo. (B) Tagliare il pezzo di inserto che contiene la fetta. (C) Posizionare ogni fetta nei quadrati disegnati con la penna idrofobica e avviare la fase di permeabilizzazione/blocco. (D) Dopo aver concluso il protocollo, finire montando le fette in mezzo di montaggio, coprendo con un copripavimenti in vetro e circondandolo con smalto per unghie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Representative Results
Sulla base delle precedenti descrizioni dell'analisi del segnale epilettico nelle fette ippocampali organotipiche, le scariche epilettiche interictali sono qui definite come scariche parossismiche che si distinguono chiaramente dall'attività di fondo, con un brusco cambiamento di polarità e che si verificano a bassa frequenza (<2 Hz). Le scariche parossismiche che durano più di 10 s e che si verificano a frequenza più elevata (≥2 Hz) sono caratterizzate come attività epileptiforme ictale. Se un evento ictal si verifica entro 10 s dal precedente, questi due eventi sono considerati come un solo evento ictal.
Le fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo a 7 DIV (Figura 3A) raffigurano attività interictali e ictali miste. Al 14 DIV (Figura 3B), l'attività spontanea è caratterizzata da scarichi ictali, che si evolvono in un'attività ictal travolgente a 21 DIV, con eventi ictal della durata di >1 min (Figura 3C).
Figura 3: Attività epileptiforme spontanea delle fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. Eventi elettrografici rappresentativi simili a convulsioni, registrati dall'area CA3 in una camera di tipointerfaccia,dopo ( A ) 7 DIV, (B) 14 DIV e (C) 21 DIV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Test di assorbimento PI seguito da immunoistochimica contro il marcatore neuronale NeuN volto a identificare la morte neuronale. L'assorbimento di PI da parte di neuroni granulari e piramidali è stato osservato in 7 fette DIV (frecce nella figura 4A), ma il numero di PI+ neuroni è aumentato a 14 DIV (frecce nella figura 4B),corroborando un aumento della morte neuronale con progressione dell'epileptogenesi.
Figura 4: Immagini rappresentative delle fette organotipiche della corteccia rhinal macchiata NeuN e PI. Immagini di neuroni maturi macchiati NeuN e cellule PI-positive sono state acquisite a (A) 7 DIV e (B) 14 DIV, su un microscopio laser confocale con un obiettivo 20x. Vengono visualizzate immagini ingrandite delle aree tratteggiate. Le frecce indicano i neuroni della morte (in arancione). Barra di scala, 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Una doppia colorazione di Iba1, insieme a CD68, è stata utilizzata per valutare il fenotipo della microglia. Iba1 è un marcatore di microglia/macrofagi, mentre il CD68 è una proteina lisosomiale espressa in alti livelli da microglia reattiva e in bassi livelli da microglia a riposo. A 7 fette DIV, le microglia ramificate con un'espressione CD68 bassa (frecce nella figura 5A) sono più abbondanti di Iba1+/CD68+ microglia reattive (punte di freccia nella figura 5A), mentre a 14 DIV, in tutte le aree dell'ippocampo, Iba1+/CD68+ microglia M1 folta/ameboide (punte di freccia nella figura 5B) superano le microglia con un'espressione CD68 bassa (frecce nella figura 5B). A 14 DIV è possibile individuare alcune cellule Iba1+/CD68+ con un aspetto iper-ramificazione (punte di freccia aperte nella Figura 5B), che potrebbero suggerire il verificarsi del fenotipo antinfiammatorio M2 delle microglia. Tuttavia, la questione richiede ulteriori studi.
Studi recenti hanno dimostrato che diverse lesioni del SNC che iniziano possono provocare almeno due tipi di astrociti reattivi, A1 e A2, con astrociti A1 neurotossici16. Il sottotipo A1 di astrociti è caratterizzato da una maggiore espressione del complemento C316,17,18. Il complemento C3, che svolge un ruolo centrale nell'attivazione del sistema di complementi, genera C3b, che viene ulteriormente degradato a iC3b, C3dg e C3d19. Pertanto, una doppia colorazione di GFAP e C3d è stata utilizzata per valutare l'astrogliosi. A 7 DIV l'espressione di C3d è appena rilevabile (Figura 6A), mentre in 14 fette DIV si possono osservare astrociti ipertrofi GFAP+/C3d+ (punte di freccia nella figura 6B),suggerendo un'attivazione progressiva degli astrociti A1.
I risultati dimostrano una progressiva attivazione di microglia e astrociti nel corso dell'epileptogenesi, imitando gli eventi descritti nei pazienti con epilessia e nei modelli animali di questa patologia.
Figura 5: Immagini rappresentative delle fette organotipiche della corteccia renale macchiata Iba1 e CD68. Le immagini delle microglia macchiate Iba1 e CD68, e dei nuclei macchiati di Hoechst, sono state acquisite a (A) 7 DIV e (B) 14 DIV, su un microscopio laser confocale con un obiettivo 20x. Vengono visualizzate immagini ingrandite delle aree tratteggiate. Le frecce puntano a Iba1+/CD68- microglia a riposo, le punte delle frecce indicano Iba1+/CD68+ microglia folta / ameboide e le punte delle frecce aperte rivelano Iba1+/CD68+ microglia iper-ramificata. Barra di scala, 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immagini rappresentative delle fette organotipiche della corteccia renale macchiata GFAP e C3d. Le immagini degli astrociti macchiati GFAP e C3d e dei nuclei macchiati di Hoechst sono state acquisite a (A) 7 DIV e (B) 14 DIV, su un microscopio laser confocale con un obiettivo 20x. Vengono visualizzate immagini ingrandite delle aree tratteggiate. Le punte delle frecce puntano a GFAP+/C3d+ astrociti A1 reattivi (in giallo). Barra di scala, 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I modelli animali di epilessia sono stati cruciali per la scoperta di molti AED, tuttavia richiedono molti animali e la maggior parte di essi richiede molto tempo a causa del periodo latente per l'insorgenza delle convulsioni. Anche l'induzione a basso contenuto di magnesio dell'attività epileptiforme nelle fette acute ippocampali è stata completamente rivista nellaletteratura 3, ma le fette acute hanno una vitalità di 6-12 ore rendendo impossibile valutare i cambiamenti a lungo termine. Le fette organotipiche possono essere mantenere in coltura da giorni a settimane, permettendo di superare il breve tempo di vitalità delle fette acute, e sono stati proposti modelli di epileptogenesi nelle fette ippocampali organotipiche3,7,8.
Qui descriviamo la preparazione di fette organotipiche, che comprendono la corteccia rinale e l'ippocampo. Queste fette prendono 15-20 minuti per essere preparate per animale, a partire dal sacrificio animale fino al posizionamento delle fette sugli inserti e si possono ottenere 6-8 fette per emisfero. Prestare particolare attenzione quando si apre l'emisfero per esporre l'ippocampo e quando si rimuove il tessuto dalla carta filtrante dopo l'affezione. Il tessuto in eccesso sopra l'ippocampo può anche compromettere l'integrità della fetta durante l'affettare.
Le fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo raffigurano un'attività epilettica in evoluzione simile all'epilessia in vivo. Dopo una settimana di cultura, la maggior parte delle fette raffigura un'attività mista interictale e ictal-like, che progredisce verso eventi esclusivamente simili all'ictal con il tempo nella cultura. Finora, abbiamo registrato poche scariche interictali a fette con 2-3 settimane. In questo sistema, l'attività epilettica sembra svilupparsi più velocemente che nelle fette ippocampali organotipiche. Questo potrebbe essere attribuito alla presenza della corteccia renale, che conserva la maggior parte dell'input funzionale all'ippocampo. Per affrontare pienamente questo problema, è attualmente in corso una caratterizzazione completa dei segnali epilettici visualizzati da queste fette nel tempo in cultura, come il numero e la durata degli eventi ictali, insieme alla loro ampiezza e frequenza.
Questo sistema può essere mantenuto in coltura per più di tre settimane e imita molti correlati molecolari dell'epilessia, come la morte neuronale, l'attivazione di microglia e astrociti e l'aumento della produzione di citochine pro-infiammatorie14, consentendo una caratterizzazione a lungo termine di questi aspetti. Rappresenta anche una piattaforma di screening facile da usare, in cui possono essere implementati interventi farmacologici mirati a percorsi cellulari specifici e potenziali obiettivi terapeutici. Indubbiamente, il sistema qui presentato può aiutare ad illuminare ulteriormente i meccanismi dell'epileptogenesi.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere l'Unità di Bioimaging dell'Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, per tutti i suggerimenti riguardanti l'acquisizione di immagini.
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito della sovvenzione Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) attraverso il progetto PTDC/MEDFAR/30933/2017 e Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
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