Summary
Här beskriver vi beredningen av rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Under en gradvis och kontrollerad berövande av serum, dessa skivor visar framväxande epipileptic-liknande händelser och kan betraktas som en ex vivo modell av epileptogenesis. Detta system representerar ett utmärkt verktyg för att övervaka dynamiken i spontan aktivitet, liksom för att bedöma utvecklingen av neuroinflammatoriska funktioner under epileptogenes.
Abstract
Organotypiska slice kulturer har använts i stor utsträckning för att modellera hjärnsjukdomar och anses vara utmärkta plattformar för att utvärdera ett läkemedels neuroprotektiva och terapeutiska potential. Organotypiska skivor framställs av explanterad vävnad och representerar en komplex multicellulär ex vivo-miljö. De bevarar den tredimensionella cytoarchitecture och lokala miljön i hjärnceller, upprätthåller neuronal anslutning och neuron-glia ömsesidiga interaktion. Hippocampal organotypiska skivor anses lämpliga att utforska de grundläggande mekanismerna för epileptogenes, men klinisk forskning och djurmodeller av epilepsi har föreslagit att rhinal cortex, bestående av perirhinal och entorhinal cortices, spelar en relevant roll i beslag generation.
Här beskriver vi beredningen av rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Inspelningar av spontan aktivitet från CA3-området under perfusion med komplett tillväxtmedium, vid fysiologisk temperatur och i avsaknad av farmakologiska manipuleringar, visade att dessa skivor visar utvecklande epileptiska händelser genom tiderna i kulturen. Ökad celldöd, genom propidium iodide upptag analys och gliosis, bedöms med fluorescens-kopplade immunohistokemi, observerades också. Det experimentella tillvägagångssättet som presenteras belyser värdet av rhinal cortex-hippocampus organotypiska slice kulturer som en plattform för att studera dynamiken och progressionen av epileptogenesis och att screena potentiella terapeutiska mål för denna hjärnpatologi.
Introduction
Epilepsi, en av de vanligaste neurologiska störningarna över hela världen, kännetecknas av den periodiska och oförutsägbara förekomsten av synkroniserad och överdriven neuronal aktivitet i hjärnan. Trots de olika antiepileptiska läkemedel (AEDs) som finns tillgängliga, en tredjedel av patienter med epilepsi är eldfasta till terapi1 och fortsätter att uppleva beslag och kognitiv nedgång. Dessutom hämmar tillgängliga AED kognition på grund av deras relativt generaliserade åtgärder på neuronal aktivitet. Epileptogenes är svårt att studera hos människor, på grund av de flera och heterogena epileptogenic skador, långa latenta perioder varar månader till årtionden och de vilseledande effekterna av antikonvulsiv behandling efter det första spontana beslaget.
Identifiering av potentiella terapeutiska medel för behandling av epilepsi har blivit möjlig på grund av djurmodeller av epilepsi: 1) genetiska modeller, som använder genetiskt predisponerade djur där anfall uppstår spontant eller som svar på en sensorisk stimulans; 2) Modeller av elektriska stimuleringsinducerade anfall. och 3) farmakologiska modeller av anfallsinduktion som använder pilokarin (en muscarinisk receptor agonist), kainate (en kainate receptor agonist) eller 4-aminopyridin (en kaliumkanalblockerare), bland andra. Dessa modeller var avgörande för förståelsen av beteendeförändringar, liksom molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för epilepsi, och de har lett till upptäckten av många AEDs2.
Ex vivo preparat är också ett kraftfullt verktyg för att utforska mekanismerna bakom epileptogenes och ictogenesis. Akuta hippocampal skivor, som möjliggör elektrofysiologiska studier av levande celler under en 6-12 h period, och organotypiska hippocampal skivor som kan bevaras i en inkubator under en period av dagar eller veckor har använts i stor utsträckning i studier av epileptiform aktivitet3.
Organotypiska hjärnskivor framställs av explanterad vävnad och representerar en fysiologisk tredimensionell modell av hjärnan. Dessa skivor bevarar cytoarchitecture av regionen av intresse och inkluderar alla hjärnceller och deras intercellulära kommunikation4. Den mest använda regionen för långsiktiga organotypiska kulturer är hippocampus, eftersom denna region påverkas av neuronal förlust i flera neurodegenerativa villkor. De har använts ofta för att modellera hjärnsjukdomar och anses vara utmärkta verktyg för att bedöma ett läkemedels neuroprotektiva och terapeutiska potential5,6. Modeller av epileptogenes, stroke och Aβ-inducerad toxicitet beskrevs i hippocampal organotypiska skivor7,8,9,10. Parkinsons sjukdom undersöktes i ventral mesencephalon och striatum, liksom cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypiska skivor11. Organotypiska cerebellar slice kulturer efterliknar många aspekter av axon myelination och cerebellar funktioner och är en utbredd modell för att undersöka nya terapeutiska strategier i multipel skleros12.
Klinisk forskning och djurmodeller av epilepsi har dock föreslagit att rhinal cortex, sammansatt av perirhinal och entorhinal cortices, spelar en roll i beslag generation13. Således fastställdes en modell av epileptogenes i rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor14. Under en gradvis och kontrollerad brist på serum visar rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor framväxande epileptiska-liknande händelser, till skillnad från analoga skivor som alltid hålls i ett seruminnehållande medium.
Vid epilepsi, som i många akuta och kroniska sjukdomar i centrala nervsystemet, misslyckas den neurocentriska visionen att klargöra mekanismerna bakom sjukdomsuppkomst och progression. Kliniska och experimentella bevis pekar på hjärninflammation, där mikroglia och astrocyter spelar en relevant roll, som en av nyckelaktörerna som bidrar till epileptiska processen. Farmakologiska experiment i djurmodeller av epilepsi tyder på att antiepileptogenic effekter kan uppnås genom att rikta proinflammatoriska vägar, och numera neuroinflammation betraktas som ett nytt alternativ för utveckling av terapeutiska metoder för epilepsi15.
Här beskriver vi noggrant beredningen av rhinal cortex-hippocampus organotypiska slice kulturer, liksom detaljerna för inspelning av spontan epileptiform aktivitet från dem. Vi belyser att detta system efterliknar flera neuroinflammatory aspekter av epilepsi, är således lämplig att utforska rollen av stödjeceller och neuroinflammation i denna patologi. Dessutom representerar det en lättanvänd plattform för screening av potentiella terapeutiska metoder för epilepsi.
Protocol
Den portugisiska lagstiftningen och EU:s riktlinjer (2010/63/EU) respekterades i alla förfaranden som rör skydd av djur för vetenskapliga ändamål. Alla metoder som beskrivs här godkändes av iMM:s institutionella djurskyddsorgan (ORBEA-iMM) och den nationella behöriga myndigheten (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. Beredning av rhinal cortex-hippocampus skivor
OBS: Beredningen av rhinal cortex-hippocampus skivor använder P6-7 Sprague-Dawley råttor.
- Kulturupplägg och medium förberedelse
- Dagen före kulturen, förbered de nödvändiga medierna och placera dem vid 4 °C.
- Förbered dissekeringsmedium: 25 mM glukos i Geys balanserade saltlösning (GBSS).
- Förbered odlingsmedium: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Hästserum (HS), 25 mM glukos, 30 μg/mL Gentamycin.
- Förbered underhållsmedium: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamin, 30 μg/mL Gentamycin, HS (15%, 10%, 5% och 0%).
- Hjärnskörd
- Strax innan du börjar kulturen, tillsätt 1,1 ml kulturmedium till varje brunn på 6-brunnsplattan med en P1000-pipett och placera den vid 37 °C.
- Placera all utrustning (dissekeringsmikroskop, vävnadshackare, dissekeringslampa, dissekeringsverktyg, elektroder, plattor, skär och filterpapper) inuti det biologiska säkerhetsskåpet och sterilisera under UV-ljus i 15 minuter.
- Justera skivans tjocklek till 350 μm.
- Dra ut GBSS från kylskåpet. Tillsätt 5 ml GBSS till sex Petri-rätter. Sex petriskålar kommer att krävas per djur.
- Avliva råttpuppen. Utför halshuggning med hjälp av en skarp sax vid basen av djurets hjärnstam.
- Tvätta djurhuvudet tre gånger i kallt GBSS och ta in det i säkerhetsskåpet.
- Vävnadsisolering och beredning av skivor
- Sätt in vassa tångar ordentligt i ögonhålorna för att hålla huvudet.
- Använd en tunn sax och skär huden/hårbotten längs mittlinjen från kotan mot frontalloberna och lägg den åt sidan.
- Skär på samma sätt skallen och längs den cerebrala tvärgående sprickan (rymden mellan hjärnan och lillhjärnan). Med böjda långa tångar, flytta isär den.
- Kassera luktlökarna med en spatel. Ta bort hjärnan från huvudet och placera den i iskallt GBSS med den dorsala ytan uppåt (Figur 1A).
- För in de fina tångarna i lillhjärnan och gå längs mittlinjen med spatelöppningen varje halvklot mycket försiktigt (Figur 1B).
- Med korta kurvtångar, ta försiktigt bort överskottsvävnaden som täcker hippocampi, utan att röra hippocampalstrukturen. Skär sedan under varje hippocampus ( Figur1C).
- Plocka upp en halvklot och placera den, med hippocampus vänd uppåt, på ett filterpapper. Upprepa proceduren med den andra halvklotet och placera den parallellt med den första, i filterpapperet. Lägg filterpapperet på vävnadshackaren, med halvkloten vinkelrätt mot bladet, och skär halvkloten i 350 μm skivor (Figur 1D).
- Placera den skivade vävnaden i en petriskål med kall GBSS(bild 1E).
- Separera skivorna noggrant med hjälp av rundspetselektroderna (Figur 1F). Håll endast skivorna med en strukturellt intakt rhinal cortex och hippocampus. DG- och CA-områden bör definieras perfekt, liksom entorhinal och perirhinal cortex (Figur 1G).
- Placera varje skiva på insatsen ( bild1H-I), med en spatel och en rund spetselektrod. Ta bort överflödig dissekeringsmedium runt varje skiva med en P20-pipett (Bild 1J). Fyra rhinal cortex-hippocampusskivor kan odlas i ett enda skär (Figur 1K).
- Kulturunderhåll
- Byt medium varannan dag.
- Värm upp mediet vid 37 °C.
- Ta plåtarna från inkubatorn. Plocka upp varje skär genom att hålla plastkanten med tång (Figur 1L).
- Använd en fri hand för att aspirera mediet från brunnen. Placera insatsen tillbaka i brunnen och tillsätt 1 ml, med en P1000-pipett, av färskt varmt medium (Figur 1M). Upprepa för alla skär. Se till att inga luftbubblor fastnar mellan membranet och mediet.
OBS: Epileptiska skivor genomgår en gradvis och kontrollerad brist på serum i mediet. Från 9 dagar In Vitro (DIV) på, skivor underhålls i NBA utan HS14.
Figur 1: Detaljerad procedur för beredning av rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. A)Ta bort hjärnan från huvudet och placera den i iskallt GBSS med den dorsala ytan uppåt. B)För in tången i lillhjärnan. Öppna hjärnan genom mittlinjen och ta bort överskottsvävnaden över hippocampus. C)Med en spatel skuren under hippocampus, enligt pilarnas angivenhet. (D) Placera både hippocampi uppåt och parallellt med varandra på filterpapperet och skär 350 μm skivor på vävnadshackern. (E) Placera den skivade hippocampusen i iskallt GBSS. (F) Separera skivorna med hjälp av runda glaselektroder. (G) Välj endast de skivor som avbildar en intakt rhinal cortex och hippocampus. (H, I) Med hjälp av en rund tippad glaselektrod tryck varje skiva till spateln och placera den på insatsen. (J) Ta bort GBSS som omger segmentet. (K) Placera fyra segment per insats. (L) För att byta medium, lyft insatsen och aspirera mediet med en glaspipett. (M) Tillsätt färskt medium genom att placera pipetten mellan insatsen och väggarna på 6-brunnsplattan. Se till att det inte finns några luftbubblor under skivorna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
2. Elektrofysiologiska inspelningar
OBS: Elektrofysiologiska inspelningar utfördes i rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor vid 7, 14 och 21 DIV i en gränssnitt-typ kammare. Inspelningar erhölls med en förstärkare, digitaliserades och analyserades med programvara. Alla inspelningar var bandpassfiltrerade (åttapolig Bessel-filter vid 60 Hz och gaussiskt filter vid 600 Hz).
- Förberedelse av inställningar
- Förbered 50 ml NBA-medium med 1 ml B27 och 250 μL L-glutamin. Värm upp vid 37 °C.
- Ställ in elektrofysiologiinställningen i nära krets. Kontrollera om flödeshastigheten är 2 ml/min.
- Öppna kartongventilen (5% CO2/95% O2)och kontrollera vattennivån i systemet.
- Lägg filterpapperet i gränssnittsinspelningskammaren för att tömma överflödigt medium och linsrengöringspapperet under ramen för att leverera medium till skivan.
- Slå på temperaturregulatorn, förstärkarna och mikromanipulatorn.
- Låt temperaturen i gränssnittskammaren stabiliseras vid 37 °C innan inspelningarna påbörjas.
- Förbered konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM glukos, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 med pH 7,4) och använd den för att fylla glaselektroden med en spruta. Placera den i den mottagande elektroden.
- Inspelningar av spontan aktivitet
- När temperaturen är stabil, ta bort plattan från inkubatorn och skär en skiva från insatsen med ett mycket vasst blad. Placera den i en 60 mm platta med en droppe medium. Ta den till gränssnittsinspelningskammaren.
- Placera skivan i gränssnittskammaren med hippocampus längst ner till höger. Placera den mottagande elektroden i CA3-pyramidcellslagret.
- Fortsätt till det kontinuerliga förvärvsprotokollet och spela in i 30 minuter.
3. PI upptagsanalys
OBS: Celldöden bedömdes genom övervakning av cellulära upptaget av fluorescerande färgämne propidium iodid (PI). PI är en polarförening som kommer in i celler med skadade cellmembran och interagerar med DNA som avger röd fluorescens (absorbans 493 nm, emission 630 nm). Eftersom PI inte är genomtränglig för levande celler används den för att upptäcka döda celler i en population.
- PI inkubation
- Förbered, i odlingsmedium, en färsk 1:10 utspädning av PI-beståndet.
- För PI upptagsanalys ta bort plattan från inkubatorn och höj försiktigt insatsen. Tillsätt 13 μL PI till mediet, med en P20-pipett, och få en slutlig koncentration på 2 μM. Omrör långsamt plattan innan du sätter tillbaka insatsen på plats. Se till att det inte finns några bubblor under skivorna.
- Sätt tillbaka skivorna i inkubatorn på 37 °C i 2 timmar.
- Fortsätt med immunohistokemi protokollet, som beskrivs i nästa avsnitt. Täck plattorna med aluminium, eftersom PI är ljuskänsligt.
4. Immunohistokemi
OBS: I immunohistokemi användes en neuron specifik antikropp, liksom antikroppar som kan diskriminera vila och reaktiva fenotyper av microglia och astrocyter, för att utvärdera utbredningen av neuronal död och gliosis i rhinal cortex-hippocampus epileptiska-liknande organotypiska skivor.
- Vävnad fixering
- Ta bort plattan från inkubatorn och aspirera mediet. Fixera skivorna med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 h vid RT genom att tillsätta 1 ml PFA under och ovanför skivorna, med en P1000-pipett.
- Ta bort PFA och tillsätt 1 ml PBS. Lägg också till PBS under och ovanför segmenten.
- Håll skivorna vid 4 °C i PBS tills de används vidare. Lägg alltid parafilm runt plattorna för att undvika torkning.
- Immunostaining steg
- Tvätta två gånger, 10 min varje gång, med 1 ml PBS.
- Förbered permeabiliserings-/blockeringslösning som innehåller 1% Triton-X100, 10% HS och 10% BSA i PBS. Förbered 5% BSA-lösning.
- Rita två rektanglar med den hydrofobiska pennan (Figur 2A). Skär skivorna från insatsen ( bild2B) med ett mycket vasst blad. Lägg två skivor per bild (bild 2C) och tillsätt 140 μL permeabiliserings-/blockeringslösning ovanpå varje segment med en P200-pipett. Inkubera i 3 h på RT.
- Späd de primära antikropparna mot arbetsspädningen i 5% BSA i PBS. Inkubera med de primära antikropparna över natten vid 4 °C.
- Inkubera med de sekundära antikropparna i 4 timmar vid RT. Skydda plattan från ljus från ljus från detta steg eftersom fluorforer bearbetas med.
- Placera en 50 μL droppe Hoechst-lösning ovanpå varje skiva och inkubera i 20 minuter på RT.
- Tvätta mellan inkubationer. Tvätta alltid tre gånger, i 10 min varje gång, med PBS-T.
- Ta bort Hoechst och tvätta enligt rekommendationerna.
- Tillsätt 50 μL monteringsmedium på toppen av varje skiva. Täck med ett glaslock och omge med nagellack(figur 2D).
- Låt det torka på RT i 24 timmar.
- Visualisera immunostaining under ett konfokalt mikroskop. Håll de färgade skivorna vid -20 °C.
Figur 2: Särskilt förfarande för immunohistokemianalysen. A)Med den hydrofobiska pennan rita två rutor i bilden. B)Skär den bit av skäret som innehåller segmentet. C)Placera varje skiva i rutorna som ritas med den hydrofobiska pennan och starta permeabiliserings-/blockeringssteget. (D) När protokollet har avslutats, avsluta med att montera skivorna i monteringsmedium, täcka med ett glaslock och omge det med nagellack. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Representative Results
Baserat på tidigare beskrivningar av epileptisk signalanalys i organotypiska hippocampal skivor definieras interictal epileptiforma utsläpp här som paroxysmala urladdningar som tydligt skiljer sig från bakgrundsaktivitet, med en plötslig förändring i polaritet och inträffar vid låg frekvens (<2 Hz). Paroxysmala utsläpp som varar mer än 10 s och inträffar vid högre frekvens (≥2 Hz) kännetecknas som ictal epileptiform aktivitet. Om en ictal händelse inträffar inom 10 s efter den föregående, betraktas dessa två händelser som endast en ictal händelse.
Rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor vid 7 DIV (Figur 3A) visar blandad interictal och ictal-liknande aktivitet. Vid 14 DIV (Figur 3B) kännetecknas spontan aktivitet av ictala utsläpp, som utvecklas till en överväldigande ictal aktivitet vid 21 DIV, med ictal händelser som varar >1 min (Figur 3C).
Figur 3: Spontan epileptiform aktivitet av rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Representativa elektrografiska beslag-liknande händelser, inspelade från CA3 område i en gränssnitt-typ kammare, efter(A) 7 DIV, (B) 14 DIV och (C) 21 DIV. Beslag detaljer visas i lägre spår. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
PI upptag analys följt av immunohistokemi mot neuronal markör NeuN syftar till att identifiera neuronal död. PI upptag av granulat och pyramidala nervceller observerades i 7 DIV skivor (pilar i figur 4A),men antalet PI+ nervceller ökade vid 14 DIV (pilar i figur 4B),bekräftar en ökad neuronal död med epileptogenes progression.
Figur 4: Representativa bilder av neun- och PI-färgade rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Bilder av NeuN-färgade mogna nervceller och PI-positiva celler förvärvades vid (A) 7 DIV och (B) 14 DIV, på ett konfokalt lasermikroskop med ett 20x mål. Förstorade bilder av de streckade områdena visas. Pilar pekar på dödsneuroner (i orange). Skalbar, 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
En dubbel färgning av Iba1, tillsammans med CD68, användes för att utvärdera microglia fenotyp. Iba1 är en mikroglia/makrofages markör, medan CD68 är ett lysosomal protein uttryckt i höga nivåer av reaktiva mikroglia och i låga nivåer genom vila mikroglia. Vid 7 DIV-skivor är förgremat mikroglia med ett lågt CD68-uttryck (pilar i figur 5A)rikligare än Iba1+/CD68+ reaktiv mikroglia (pilspetsar i figur 5A), medan vid 14 DIV, I alla delar av hippocampus överskrider Iba1+/CD68+ buskig/amöeboid M1 mikroglia (pilspetsar i figur 5B)mikroglia med ett lågt CD68-uttryck (pilar i figur 5B). Vid 14 DIV kan vissa Iba1+/ CD68+ celler med ett hyper-förgreningsutseende identifieras (öppna pilspetsar i figur 5B), vilket kan föreslå förekomsten av M2 antiinflammatorisk fenotyp av mikroglia. Denna fråga kräver dock ytterligare studier.
Nyligen genomförda studier visade att olika initiera CNS skador kan framkalla minst två typer av reaktiva astrocyter, A1 och A2, med A1 astrocyter är neurotoxiska16. A1 subtyp av astrocyter kännetecknas av ett ökat uttryck av komplement C316,17,18. Komplement C3, som spelar en central roll i aktiveringen av komplementsystemet, genererar C3b, som ytterligare försämras till iC3b, C3dg och C3d19. Således användes en dubbel färgning av GFAP och C3d för att bedöma astrogliosis. Vid 7 DIV är uttrycket av C3d knappt detekterbart (Figur 6A), medan i 14 DIV-skivor hypertrofa GFAP+/ C3d+ astrocyter kan observeras (pilspetsar i figur 6B), vilket tyder på en progressiv aktivering av A1 astrocyter.
Resultaten visar en progressiv aktivering av microglia och astrocyter under hela epileptogenes, härma de händelser som beskrivs hos patienter med epilepsi och i djurmodeller av denna patologi.
Figur 5: Representativa bilder av Iba1- och CD68-färgade rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Bilder av Iba1 och CD68 färgade microglia, och Hoechst färgade atomkärnor, förvärvades på (A) 7 DIV och (B) 14 DIV, på ett confocal laser mikroskop med ett 20x mål. Förstorade bilder av de streckade områdena visas. Pilarna pekar på Iba1+/ CD68- vilande mikroglia, pilspetsar indikerar Iba1+/ CD68+ buskig / amöeboid microglia och öppna pilspetsar avslöjar Iba1+/ CD68+ hyper-ramifierad mikroglia. Skalbar, 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Representativa bilder av GFAP och C3d färgade rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Bilder av GFAP och C3d färgade astrocyter, och Hoechst färgade atomkärnor, förvärvades vid (A) 7 DIV och (B) 14 DIV, på ett confocal laser mikroskop med ett 20x mål. Förstorade bilder av de streckade områdena visas. Pilspetsar pekar på GFAP+/C3d+ reaktiva A1-astrocyter (i gult). Skalbar, 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Djurmodeller av epilepsi har varit avgörande för upptäckten av många AEDs, men de kräver många djur och de flesta av dem är tidskrävande på grund av den latenta perioden för anfallsuppkomst. Låg magnesium induktion av epileptiform verksamhet i hippocampal akuta skivor har också reviderats grundligt ilitteraturen 3, men akuta skivor har en 6-12 h livskraft gör det omöjligt att bedöma långsiktiga förändringar. Organotypiska skivor kan bibehållas i kulturen från dagar till veckor, vilket gör det möjligt att övervinna den korta livskraftstiden för akuta skivor, och modeller av epileptogenes i organotypiska hippocampal skivor har föreslagits3,7,8.
Här beskriver vi beredningen av organotypiska skivor, bestående av rhinal cortex och hippocampus. Dessa skivor tar 15-20 min att förbereda per djur, från djuroffer till placering av skivor på skären, och 6-8 skivor per halvklot kan erhållas. Extra försiktighet måste vidtas när du öppnar halvklotet för att exponera hippocampus och när du tar bort vävnaden från filterpapperet efter skivning. Överskott av vävnad ovanför hippocampus kan också äventyra skivans integritet under skivning.
Rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor visar en utvecklande epileptisk-liknande aktivitet som liknar in vivo epilepsi. Efter en vecka i kultur skildrar de flesta skivor blandad interictal och ictal-liknande aktivitet, som fortskrider till enbart ictal-liknande händelser med tiden i kulturen. Hittills har vi registrerat få interictal urladdningar i skivor med 2-3 veckor. I detta system verkar epileptisk-liknande aktivitet utvecklas snabbare än i organotypiska hippocampal skivor. Detta kan hänföras till närvaron av rhinal cortex, som bevarar det mesta av den funktionella ingången till hippocampus. För att helt ta itu med det här problemet utförs för närvarande en fullständig karakterisering av de epileptiska signaler som visas av dessa segment under hela tiden i kulturen, till exempel antal och varaktighet för ictal-händelser, tillsammans med deras amplitud och frekvens.
Detta system kan upprätthållas i kultur i mer än tre veckor och efterliknar många molekylära korrelater av epilepsi, såsom neuronal död, aktivering av mikroglia och astrocyter och ökad produktion av proinflammatoriska cytokiner14, vilket möjliggör en långsiktig karakterisering av dessa aspekter. Det representerar också en lättanvänd screeningplattform, där farmakologiska interventioner riktade mot specifika cellulära vägar kan genomföras och potentiella terapeutiska mål kan testas. Utan tvekan kan systemet häri bidra till att ytterligare upplysa epileptogenes mekanismerna.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma Bioimaging Unit of Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, för alla förslag om bildförvärv.
Detta projekt har fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för bidragsavtal Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) genom Projekt PTDC/Medfar/30933/2017 och Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A.
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
