Stabilitet og struktur av Bat Major Histocompatibility Complex klasse I med heterologøse β2-Microglobulin
Summary
Protokollen beskriver eksperimentelle metoder for å oppnå stabile store histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I gjennom potensielle β 2-mikroglobulin (β2m) substitusjoner fra forskjellige arter. Den strukturelle sammenligningen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m ble undersøkt.
Abstract
Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) spiller en avgjørende rolle i antigenpeptidpresentasjon og T-celle immunresponser mot smittsom sykdom og tumorutvikling. Hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m) substitusjon fra forskjellige arter kan stabiliseres in vitro. Dette er et mulig middel for å studere MHC I av pattedyr, når homologe β2m ikke er tilgjengelig. I mellomtiden er det indikert at β2m substitusjon ikke påvirker peptidpresentasjonen betydelig. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien for hybrid MHC I kompleks med heterolog β2-microglobulin (β2m). Her presenteres metoder for å evaluere muligheten for heterolog β2m substitusjon i MHC I-studien. Disse metodene inkluderer utarbeidelse av uttrykkskonstruksjoner; rensing av inklusjonsorganer og refolding av MHC-komplekset; bestemmelse av protein termobilitet; krystall screening og struktur bestemmelse. Denne studien gir en anbefaling for å forstå funksjon og struktur av MHC I, og er også viktig for T celle respons evaluering under smittsom sykdom og tumor immunterapi.
Introduction
Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC) finnes i alle virveldyr og er et sett med gener som bestemmer den cellemedierte immuniteten mot smittsomme patogener. MHC klasse I presenterer endogene peptider, for eksempel viruskomponenter produsert ved virusinfeksjon, til T cellereseptorer (TCR) på overflaten av CD8+ T-celler for å megle cellulær immunitet og delta i immunregulering1. En strukturell studie av MHC I binding til peptider gir informasjon om peptidbindende motiver og presentasjonsfunksjoner av MHC I molekyler, som spiller viktige roller i evalueringen av CD8+ T celle immunresponser og vaksineutvikling.
Siden den første krystalliseringen og strukturelle bestemmelsen av MHC I molekylær av Bjorkman et al. 2 , har krystallstrukturanalysen av MHCI-molekyleri stor grad fremmet forståelsen av hvordan peptider binder seg til MHC I molekyler, og bidrar til å forstå samspillet mellom lette kjeder med tunge kjeder og peptider. En rekke oppfølgingsstudier indikerte at selv om genene som koder lyskjeden ikke er forbundet med MHC, er lyskjeden et viktig protein for montering av MHCI-molekyler 3,4. Den samhandler med de tre domenene i MHC klasse I molekyler på flere overflater. Når lyskjeden er fraværende, kan mhc klasse I molekyler ikke uttrykkes riktig på overflaten av antigen-presentere celler og kan ikke samhandle med TCR for å utøve sine immunologiske funksjoner.
MHC I består av et tungt kjede (H-kjede) og lett kjede (f.eks. β2-mikroglobulin (β2m)), og monteres gjennom binding til et egnet peptid5. Det ekstracellulære segmentet av H-kjeden består av α1-, α2- og α3-domener6. α1- og α2-domenene danner peptidbindingssporet (PBG). Den β2m kjeden fungerer som en strukturell underenhet av monteringskomplekset i MHC I, stabiliserer konformasjonen av komplekset, og er en molekylær chaperone for MHC I H kjede folding7,8,9. En rekke studier har vist at MHC I H kjeder fra ulike pattedyr som (Chiroptera) (Ptal-N * 01:01)10, rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd)14,15, hund (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, storfe (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 og equine (Perissod (Eqca-N*00602 og Eqca-N*00601)18 kan kombineres med heterolog β2m (tabell 1). Disse hybridmolekylene brukes ofte i strukturelle og funksjonelle studier. Metoden for den funksjonelle og strukturelle studien av hybrid MHC I med heterologøse β2m er imidlertid ennå ikke oppsummert. Samtidig er det strukturelle grunnlaget for det omskiftede β2m mellom ulike taxa fortsatt uklart.
Heri oppsummeres prosedyren for MHC I-uttrykk, refolding, krystallisering, krystalldatainnsamling og strukturbestemmelse. I tillegg analyseres potensielle substitusjoner på β2m fra forskjellige arter gjennom å sammenligne den strukturelle konformasjonen av MHC I stabilisert av homolog og heterolog β2m. Disse metodene vil være nyttige for videre MHC I strukturell studie og CD8+ T celle immunrespons evaluering i kreft og smittsomme sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Byggingen av et hybridproteinkompleks gjennom heterologisk substitusjon fra ulike taxa er en vanlig strategi for funksjonelle og strukturelle undersøkelser når homologkomplekset ikke er tilgjengelig, for eksempel i MHC I og dets ligandes. Det er imidlertid begrenset oppsummering av metodikken og teknologien. Heri ble strukturen til MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisert av bβ2m eller hβ2m analysert. De viktigste aminosyrene til β2m binding til Ptal-N * 01: 01 ble funnet å være bevart mel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av det åpne fondet for statlige viktige laboratorier for farmasøytisk bioteknologi, Nan-jing University, Kina (Grant no. KF-GN-201905), National Natural Science Foundation of China (bevilgninger 81971501). William J. Liu støttes av Excellent Young Scientist Program fra NSFC (81822040) og Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
