배트 메이저 조직적합성 복합클래스 1등급 의 안정성 및구조 β 2-마이크로글로불린
Summary
이 프로토콜은 다른 종으로부터 잠재적 인 β2-microglobulin (β2m)대체를 통해 안정적인 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I를 얻는 실험 방법을 설명합니다. 동종 β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 비교가 조사되었다.
Abstract
주요 조직 적합성 복합체(MHC)는 전염병 및 종양 발달에 대한 항원 펩타이드 프리젠테이션 및 T 세포 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 이종β2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC는 체외에서 안정화될 수 있다. 이것은 동종 β2m를사용할 수 없을 때 포유류의 MHC I를 연구하는 가능한 수단입니다. 한편, 포유류 β2m대체가 펩타이드 프리젠테이션에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 이종성 β 2-마이크로글로불린(β2m)으로복합된 하이브리드 MHC에 대한 방법론 및기술에 관한 요약이 제한되어 있다. 본명, 이종성의 타당성을 평가하는 방법은 MHC에서2m치환β 연구가 제시된다. 이러한 메서드에는 식 구문 준비가 포함됩니다. 포함 체의 정화 및 MHC 복합체의 재접기; 단백질 열안정성의 결정; 크리스탈 스크리닝 및 구조 결정. 본 연구는 MHC I의 기능 및 구조를 이해하기 위한 권장 사항을 제공하며, 또한 전염병 및 종양 면역 요법 중 T 세포 반응 평가를 위해 유의하다.
Introduction
주요 조직 적합성 복합체 (MHC)는 모든 척추 동물에 존재하며 전염성 병원체에 대한 세포 매개 면역을 결정하는 유전자 세트입니다. MHC 클래스 I는 바이러스 감염시 생성된 바이러스 성분과 같은 내인성 펩티드를CD8+ T 세포 표면에 T 세포 수용체(TCR)에 제시하여 세포 면역을 중재하고 면역 조절1에참여한다. 펩티드에 결합하는 MHC I의 구조 연구는 CD8+ T 세포 면역 반응 및 백신 개발의 평가에 중요한 역할을 하는 MHC I 분자에 의한 펩티드 결합 모티프 및 프리젠테이션 기능에 관한 정보를 제공합니다.
BJorkman 외2에의한 MHC I 분자의 첫 번째 결정화 및 구조적 결정 이후, MHC I 분자의 결정 구조 분석은 펩티드가 MHC I 분자에 결합하는 방법에 대한 이해를 크게 촉진하고, 무거운 사슬 및 펩티드와 광사슬의 상호 작용을 이해하는 데 도움이 된다. 일련의 후속 연구는 광 사슬을 코딩하는 유전자가 MHC와 관련이 없지만, 광 사슬은 MHC I 분자3,4의조립을 위한 핵심 단백질임을 나타냈다. 그것은 여러 표면에 MHC 클래스 I 분자의 세 가지 도메인과 상호 작용. 광사슬이 없을 때, MHC 급 I 분자는 항원 제시 세포의 표면에 정확하게 표현될 수 없고 그들의 면역 기능을 발휘하기 위하여 TCR과 상호 작용할 수 없습니다.
MHC I는 중형 체인(H 체인)과 라이트 체인(즉,β 2-마이크로글로불린(β2m)으로구성되며, 적합한 펩타이드5에결합하여 조립된다. H 사슬의 세포외 세그먼트는 α1, α2 및 α3 도메인6로구성됩니다. α1 및 α2 도메인은 펩타이드 결합 홈(PBG)을 형성한다. β2m체인은 MHC I내 조립 단지의 구조적 서브유닛으로서 작용하여 복합체의 변형을 안정화하고, MHC I H 체인 접이식7,8,9에대한 분자 샤페론이다. 일련의 연구에 따르면 MHC I H 체인은 박쥐(Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,레서스 마카크(영장류) (마무-B*17)11 (마무-A*01)12 (마무-A*02)13,마우스(로드엔티아)13,마우스(로드텐티아) 2K(14-14) 등 다양한 포유류로부터체인을 보였다.5,개 (카니보라) (DLA-88 *50801)16,가축 (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 및 말 (페리소다실라) (Eqca-N * 00602 및 Eqca-N * 00601)18 그는 18 과 결합 할 수있습니다.β…2.1. 이 하이브리드 분자는 종종 구조적 및 기능적 연구에서 사용됩니다. 그러나, 이종성 β2m를가진 하이브리드 MHC I의 기능및 구조 연구를 위한 방법론은 아직 요약되지 않는다. 한편, 서로 다른 택시 사이의 β2m의구조적 기반은 불분명합니다.
본명, MHC I 발현, 재접이식, 결정화, 결정데이터 수집 및 구조 결정에 대한 절차가 요약된다. 또한, 상이한 종으로부터β 2m의잠재적 대체는 동종 및 이종β2m에의해 안정화된 MHC I의 구조적 형성을 비교하여 분석된다. 이러한 방법은 암 및 전염병에서 추가 MHC I 구조 연구 및 CD8+ T 세포 면역 반응 평가에 도움이 될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 taxa로부터 이종 대체를 통한 하이브리드 단백질 복합체의 시공은 MHC I 및 리간드와 같이 동종 복합체가 제공되지 않을 때 기능및 구조적 조사를 위한 일반적인 전략이다. 그러나 방법론 및 기술에 대한 요약은 제한적입니다. 본명, 박쥐 MHC I, Ptal-N*01:01의 구조, bβ2m 또는 hβ2m에 의해 안정화된 구조가 분석되었다. Ptal-N*01:01에 결합하는 β2m의주요 아미노산은 박쥐와 인간…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 제약 생명 공학의 국가 핵심 실험실의 오픈 펀드에 의해 지원되었다, 난징 대학, 중국 (그랜트 번호. KF-GN-201905), 중국 국립 자연과학 재단 (보조금 81971501). 윌리엄 J. 리우NSFC (81822040)와 베이징 신스타 과학 기술 계획 (Z18100006218080)의 우수 젊은 과학자 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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