Summary

Стабильность и структура Bat Major Histocompatibility Complex Class I с гетерологическим β2-Микроглобулин

Published: March 10, 2021
doi:

Summary

Протокол описывает экспериментальные методы получения стабильного крупного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I через потенциальные β 2-микроглобулин (β2 м)замены различных видов. Исследовано структурное сравнение MHC I, стабилизированное гомологичным и β2 м.

Abstract

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) играет ключевую роль в представлении пептида антигена и иммунных реакций Т-клеток против инфекционных заболеваний и развития опухоли. Гибрид MHC I, сложный с гетерологическим β 2-микроглобулин (β2 м)замена от различных видов может быть стабилизирована в пробирке. Это осуществимое средство для изучения MHC I млекопитающих, когда гомологичный β2 мнедоступен. Между тем, указывается, что β2 м заменане существенно влияет на пептидную презентацию. Тем не менее, существует ограниченное обобщение относительно методологии и технологии для гибридногоMHC I, сложного с гетерологическим β 2-микроглобулином (β2 м). В этом случае представлены методы оценки осуществимости β2 мзамены в исследовании MHC I. Эти методы включают подготовку конструкций выражения; очистка инклюзивных тел и повторное сложение комплекса МХК; определение термостабельности белка; кристаллический скрининг и определение структуры. Это исследование дает рекомендацию для понимания функции и структуры MHC I, а также имеет важное значение для оценки реакции Т-клеток во время инфекционных заболеваний и иммунотерапии опухоли.

Introduction

Основной комплекс гистосовместимости (MHC) существует у всех позвоночных и является набором генов, который определяет клеточный иммунитет к инфекционным патогенам. MHC класса I представляет эндогенные пептиды, такие как вирусные компоненты, вырабатываемые при вирусной инфекции, Т-клеточных рецепторов (TCR) на поверхностиCD8 и Т-клеток для окаймляют клеточный иммунитет и участвовать в иммуннойрегуляции 1. Структурное исследование MHC I связывания с пептидами предоставляет информацию о пептидных связывающих мотивов и особенностей представления молекул MHC I, который играет жизненно важную роль в оценкеCD8 и Т-клеток иммунной реакции и разработки вакцины.

С момента первой кристаллизации и структурного определения MHC I молекулярной Bjorkman et al.2, анализ кристаллической структурымолекул MHC I значительно способствовал пониманию того, как пептиды связываются с молекулами MHC I, и помогает понять взаимодействие световых цепей с тяжелыми цепями и пептидами. Серия последующих исследований показала, что, хотя гены, кодирующие световую цепь, не связаны с MHC, световая цепь является ключевым белком для сборки молекул MHC I3,4. Он взаимодействует с тремя областями молекул класса I MHC на нескольких поверхностях. Когда световая цепь отсутствует, молекулы класса I MHC не могут быть правильно выражены на поверхности антигеносующих клеток и не могут взаимодействовать с TCR для оказания своих иммунологических функций.

MHC I состоит из тяжелой цепи (H цепи) и световой цепи (т.е. β2-микроглобулин (β2 м))и собирается через привязку к подходящемупептиду 5. Внеклеточный сегмент цепочки H состоит из доменов No1, No2 и No36. Домены No1 и No2 образуют пептидную связывающую канавку (PBG). Цепочка β2 мвыступает в качестве структурного подразделения сборочного комплекса в MHC I, стабилизирующей конформацию комплекса, и является молекулярным сопровождаем для цепи MHC I H,складываемой 7,8,9. Серия исследований показала, что MHC I H цепи из различных млекопитающих, таких как летучая мышь (Хироптера) (Ptal-N-01:01)10, резус макаки (Приматы) (Маму -Би-17)11 (Маму-АЗ01)12 (Маму-АЗ02)13, мышь (Родентия) (H-2Kd)14,15, собака (Carnivora) (DLA-88’50801)16, крупный рогатый скот (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 и лошади (Перисodactyla) (Eqca-N-00602 и Eqca-N’00601)18 может сочетаться с гетерологическими β2 м(Таблица 1). Эти гибридные молекулы часто используются в структурных и функциональных исследованиях. Однако методология функционального и структурного исследования гибридного MHC I с гетерологическим β2 мпока не обобщена. Между тем, структурная основа для взаимозаменяемых βмеждуразличными таксами остается неясной.

В этом случае суммируются процедуры выражения MHC I, повторного сплещания, кристаллизации, сбора кристаллических данных и определения структуры. Кроме того, анализируются потенциальные замены β2 му различных видов путем сравнения структурной конформации MHC I, стабилизированной гомологичным и гетерологическим β2 м. Эти методы будут полезны для дальнейшего структурного исследования MHC I и CD8 иоценки иммунного ответа Т-клеток при раке и инфекционных заболеваниях.

Protocol

1. Подготовка выражений конструкций Извлекаем последовательности генов класса I MHC (включая прогнозируемые гены) из базы данных NCBI. Извлечение более высоких последовательностей тяжелых цепей млекопитающих MHC I из базы данных иммуно полиморфизма (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) и базы данных U…

Representative Results

Предыдущая работа сообщила, что геВ-производные HeV1 (DFANTFLP) пептид был представлен Ptal-N’01:0110,19. В этом случае была оценена связывающая способность этого пептида к Птал-НО01:01 с гомологичной летучей мышью β<font face="Helvetica Neue, Arial, sans-se…

Discussion

Строительство гибридного белкового комплекса через гетерологичную замену из различных такс является общей стратегией для функциональных и структурных исследований, когда гомологичный комплекс недоступен, например, в MHC I и его лигандах. Вместе с тем существует ограниченное обобщение…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано открытым фондом государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Университет Нань-Цзин, Китай (Грант нет. KF-GN-201905), Национальный фонд естественных наук Китая (гранты 81971501). Уильям Лю поддерживается Отличной программой молодых ученых NSFC (81822040) и Пекинским новым звездным планом науки и техники (No181100006218080).

Materials

10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

References

  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
  28. McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Play Video

Cite This Article
Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

View Video